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本文利用全基因组 CRISPR 碱基编辑筛选，发现桩蛋白（PXN）δ 亚型的赖氨酸 68 位点经 K6 型泛素化修饰，通过调控内体依赖的病毒进入过程促进甲型流感病毒（IAV）复制，为抗流感病毒药物研发提供新方向。
研究背景与方法
甲型流感病毒（IAV）严重威胁公共卫生，现有疫苗和抗病毒药物面临耐药性挑战。宿主因子在病毒复制中起关键作用，全基因组 CRISPR 筛选已用于鉴定相关因子，但传统方法难以靶向功能性赖氨酸残基。本研究利用腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）构建靶向 215,689 个赖氨酸密码子的 sgRNA 文库，在 hTERT-RPE1 细胞中筛选 IAV 复制必需的宿主因子及赖氨酸位点。通过多轮病毒感染和下一代测序（NGS）分析，结合 MAGeCKiBAR 算法，鉴定出 26 个显著富集的赖氨酸密码子靶向 sgRNA，涉及 GSTM4、FLNC、HMGB1、ZNF236、GRIP1、PXN 等基因。
桩蛋白对 IAV 复制的关键作用
桩蛋白（Paxillin，由 PXN 编码）在筛选中被确定为重要宿主因子。敲低或敲除 PXN 显著降低多种 IAV 毒株（WSN、PR8、VN04-HALo、H9N2）在细胞系（A549、RPE1）中的复制，病毒滴度下降 1-2 log。在体内实验中，利用肽共轭磷酸二酰胺吗啉代寡聚物（PPMOs）抑制小鼠肺中桩蛋白表达，可减轻病毒感染引起的体重下降和肺组织损伤，病毒滴度降低约 0.5 log，50% 小鼠存活，而对照组全部死亡。Western blot 和免疫荧光显示，IAV 感染诱导桩蛋白表达上调，且与病毒核蛋白（NP）存在动态共定位，提示其在病毒感染早期发挥作用。
桩蛋白调控 IAV 进入过程
进一步研究表明，桩蛋白影响 IAV 的内体运输阶段。在病毒吸附后，敲低桩蛋白不影响病毒与细胞表面的结合，但显著减少核内 NP 的积累。酸旁路实验显示，当病毒直接在细胞膜融合进入时，桩蛋白敲低对病毒复制无显著影响，而在正常内吞途径中则抑制病毒感染，表明桩蛋白作用于病毒内吞后至膜融合前的内体运输步骤。此外，桩蛋白敲低不影响 VSV（内吞进入病毒）的复制，但对 SeV、RSV 等非内吞进入病毒无显著影响，进一步支持其在内体依赖病毒进入中的特异性作用。
桩蛋白 δ 亚型的特异性作用及分子机制
桩蛋白有 α、β、γ、δ 四种剪接亚型，其中 δ 亚型仅表达于上皮细胞，具有较短的 N 端。筛选中富集的 sgRNA 靶向桩蛋白 δ 的赖氨酸 68（K68）和 β 等亚型的赖氨酸 201（K201）。功能拯救实验表明，野生型桩蛋白 δ 可恢复敲低细胞中的病毒复制，而 K68 突变型（K68E/G/R）则不能；相比之下，桩蛋白 β 及其 K201 突变型均无法拯救病毒复制，表明 δ 亚型的 K68 位点是关键功能位点。机制研究发现，桩蛋白 δ 的 K68 位点发生 K6 型泛素化修饰，IAV 感染可下调其 K6 泛素化水平。免疫共沉淀显示，桩蛋白 δ 与病毒血凝素（HA）结合，且 K68 突变显著减弱两者的相互作用，提示 K68 泛素化可能通过促进桩蛋白 δ 与 HA 的结合，调控病毒内体运输过程。
结论与意义
本研究通过全基因组碱基编辑筛选，首次揭示桩蛋白 δ 的 K68 位点经 K6 型泛素化修饰，通过调控内体依赖的病毒进入过程促进 IAV 复制。该发现拓展了对宿主 - 病毒相互作用的理解，为开发以桩蛋白及其泛素化通路为靶点的广谱抗流感病毒药物提供了新方向。未来研究可进一步探索桩蛋白 δ 与 HA 相互作用的时空特异性及泛素化修饰的调控机制，为靶向宿主因子的抗病毒策略提供更深入的理论依据。
