YIPF5作为猪流行性腹泻病毒双膜囊泡形成的关键宿主因子：揭示冠状病毒复制新机制

本研究通过全基因组CRISPR/Cas9筛选技术，在猪源细胞系（IPEC-J2和IPI-2I）中发现YIPF5是猪流行性腹泻病毒（PEDV）复制必需宿主因子。实验证实YIPF5通过与病毒非结构蛋白（nsp3/4/6）互作，调控双膜囊泡（DMVs）形成，为冠状病毒治疗靶点开发提供新思路。

　　

基因组尺度CRISPR/Cas9筛选揭示PEDV感染关键宿主因子
研究团队通过全基因组CRISPR/Cas9敲除文库筛选，在猪肠道上皮细胞系IPEC-J2和IPI-2I中鉴定出Yip家族成员YIPF5是PEDV感染的关键宿主因子。敲除YIPF5显著抑制PEDV G1型（CV777）和G2型（LJX）毒株的复制，病毒滴度下降超90%，且对猪δ冠状病毒（PDCoV）和人冠状病毒OC43（HCoV-OC43）同样具有抑制作用。

YIPF5特异性调控病毒复制阶段
精细实验表明，YIPF5缺失不影响病毒吸附和内化过程——4°C吸附实验显示WT与敲除细胞的病毒基因组RNA（gRNA）捕获量无差异，37°C内化1小时后免疫荧光检测N蛋白信号强度相当。但感染6小时后，敲除细胞的病毒gRNA积累量骤减85%，双链RNA（dsRNA）标志物信号强度仅为对照的15%，证实YIPF5特异性作用于复制阶段。

YIPF5驱动双膜囊泡形成的分子机制
透射电镜（TEM）显示：野生型细胞感染48小时后可见典型DMVs（直径100-400 nm），而YIPF5敲除细胞中DMVs几乎消失，内质网（ER）出现异常堆叠结构。免疫电镜捕捉到YIPF5信号分布于DMVs形成的早、中、晚期，尤其在成簇DMVs连接处富集。共聚焦显微镜观察到YIPF5与dsRNA共定位，暗示其直接参与复制细胞器构建。

病毒非结构蛋白与宿主因子的精密协作
免疫共沉淀（Co-IP）证实YIPF5与PEDV跨膜蛋白nsp3、nsp4、nsp6均存在物理相互作用。三重转染实验显示，YIPF5与nsp3/nsp4共表达时会形成特征性 puncta 结构。机制上，YIPF5缺失导致nsp3-nsp4互作减弱60%，致使DMVs生成受阻；回补实验则使DMVs数量恢复至野生型水平。值得注意的是，nsp3/nsp4单独表达时可诱导小型DMVs（100-200 nm），但YIPF5敲除细胞中仅见ER膜"拉链样"异常折叠。

治疗靶点的转化价值
该研究首次在猪源细胞模型中系统解析了YIPF5通过调控DMVs形成促进冠状病毒复制的分子通路。相较于既往非自然宿主（如Vero E6）的筛选结果，本研究发现的TMEM41B、YIPF5等宿主因子更具病理相关性。YIPF5作为五跨膜蛋白，其结构域可作为小分子抑制剂设计的靶标，为开发广谱抗冠状病毒药物提供新方向。