基于核糖核蛋白的CRISPR/Cas12a系统在家蚕诱变中的应用研究

为解决家蚕基因组编辑工具单一化问题，西南大学团队开发了基于RNP的CRISPR/Cas12a系统。研究通过对比Cas9与Cas12a对FibH、mp等基因的编辑效率，证实Cas12a虽效率较低但能产生可遗传突变，并发现其活性受温度靶向依赖性影响，为鳞翅目基因研究提供了新工具。

　　

家蚕作为重要的经济昆虫和鳞翅目模式生物，其基因组编辑技术一直是研究热点。尽管CRISPR/Cas9系统已广泛应用，但其对NGG PAM序列的严格依赖限制了靶点选择。而Cas12a（原Cpf1）因识别T-rich PAM、产生交错切口等优势，成为潜在替代方案。然而，此前Cas12a仅在家蚕细胞系中完成体外验证，其体内编辑效率及受染色质结构的影响尚不明确。此外，传统转基因方法耗时漫长（家蚕世代周期约45天），而mRNA递送存在crRNA降解风险。这些瓶颈严重制约了家蚕功能基因组学研究的发展。

针对上述问题，西南大学的研究团队在《Insect Biochemistry and Molecular Biology》发表论文，首次建立了基于核糖核蛋白（RNP）的CRISPR/Cas12a体内编辑系统。研究采用RNP复合物直接递送LbCas12a蛋白与crRNA的策略，避免了外源DNA整合风险，同时显著缩短实验周期。通过设计19条crRNA和17条sgRNA分别靶向FibH（丝素重链基因）、mp（小翅基因）和Serpin（丝氨酸蛋白酶抑制剂基因），团队系统比较了两种核酸酶的编辑效率，并分析了温度（25°C vs 37°C）对Cas12a活性的影响。

关键技术包括：1）使用家蚕品种"大造"（Dazao）作为野生型对照；2）通过CHOPCHOP在线工具设计crRNA/sgRNA；3）采用胚胎显微注射RNP复合物的递送方式；4）T7EN1酶切检测突变效率；5）表型分析验证功能缺失突变。

研究结果

1. CRISPR/Cas12a系统验证：
   通过对比19个Cas12a-crRNA和17个Cas9-sgRNA的编辑效率，发现Cas12a突变率低于Cas9，但成功产生可遗传的插入缺失突变（indel）。温度实验显示Cas12a活性具有靶点依赖性——部分靶点在37°C下效率提升，而另一些在25°C更优。

2. 功能基因编辑示范：
   靶向FibH基因（控制丝蛋白合成）获得的突变体表现出预期丝腺发育异常；mp基因（参与翅发育）敲除则导致典型小翅表型。这两个案例证实Cas12a能有效破坏基因功能并产生稳定遗传的突变表型。

3. 系统优势分析：
   RNP递送避免了外源DNA整合，符合家蚕工业化应用的生物安全要求。Cas12a的T-rich PAM偏好性拓展了基因组可编辑区域，尤其适用于调控区和ncRNA基因的修饰。其自加工crRNA的特性更便于多基因编辑。

结论与意义
该研究首次实现Cas12a在家蚕体内的基因组编辑，填补了鳞翅目昆虫中该技术的空白。尽管编辑效率低于Cas9，但Cas12a系统具有独特优势：1）突破NGG PAM限制，扩展靶点选择范围；2）交错切口可能提高同源重组效率；3）RNP递送兼具快速性和生物安全性。温度依赖性活性的发现为不同实验条件优化提供指导。这项成果不仅丰富了家蚕基因研究工具库，也为其他鳞翅目害虫防治和益虫育种提供了新思路。未来通过优化crRNA设计或结合Co-CRISPR策略，有望进一步提升该系统效率。