CRISPR/Cas9介导OTOF基因敲降斑马鱼模型的建立及其在听力损伤机制研究中的意义

推荐 为探究OTOF基因突变致聋机制，研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼模型，发现otof敲降导致侧线毛细胞凋亡及HSP70氧化应激通路异常激活。该研究揭示OTOF通过调控MAPK信号和HSP70表达保护毛细胞，为遗传性耳聋机制研究提供新模型与分子靶点。

　　

论文解读
听力障碍是全球性健康问题，其中遗传性耳聋占比高达60%，而OTOF基因突变是导致非综合征性感音神经性耳聋的重要原因之一¹。OTOF编码的Otoferlin蛋白在听觉突触传递中起关键作用，但其具体病理机制仍不明确。斑马鱼因其侧线系统与哺乳动物内耳毛细胞功能相似，且具备强大的组织再生能力，成为研究听觉疾病的理想模型。本研究由杭州环特生物科技股份有限公司研究人员开展，通过CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼otofa和otofb双敲降模型，结合转录组测序分析，揭示了OTOF在维持毛细胞存活及抗氧化应激中的核心作用，为耳聋治疗提供潜在干预靶点。研究成果发表于《Gene Expression Patterns》。

研究方法
本研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对斑马鱼otofa和otofb基因进行敲降，通过胚胎显微注射Cas9蛋白与sgRNA复合物实现基因编辑。利用Tg(mpeg1:EGFP)转基因斑马鱼特异性标记巨噬细胞，结合5天龄幼鱼（5 dpf）的侧线毛细胞形态学观察及高通量RNA-seq测序，筛选差异表达基因（DEGs）并进行KEGG和GO功能富集分析。

研究结果
OTOF敲降导致毛细胞损伤与凋亡
通过CRISPR/Cas9构建的otofa和otofb双敲降斑马鱼模型显示，5 dpf时后侧线神经丘毛细胞出现显著损伤及凋亡现象，伴随巨噬细胞浸润增加。野生型AB品系斑马鱼相比，突变体体长显著缩短，提示OTOF缺失影响生长发育。

转录组异常揭示氧化应激通路激活
RNA-seq分析鉴定出334个上调DEGs和111个下调DEGs，其中HSP70氧化应激系统相关基因（如hspa1l、hspb1）显著上调。KEGG通路富集分析表明MAPK信号通路与毛细胞存活密切相关，提示OTOF可能通过调控MAPK/HSP70轴抑制氧化应激诱导的细胞凋亡。

OTOF功能保守性验证
斑马鱼OTOF蛋白与人类同源序列在C2结构域具有高度一致性（C2A-C2F结构域相似度74%-95%），其双亚型（otofa/otofb）均参与听觉传导维持。敲降实验进一步证实OTOF通过调节内质网钙稳态及突触囊泡释放，保护毛细胞免受氧化应激损伤。

研究结论
本研究成功建立首个斑马鱼OTOF基因敲降模型，证实OTOF在维持毛细胞结构完整性和听觉功能中的核心作用。转录组数据揭示HSP70介导的抗氧化应激反应是OTOF发挥保护作用的关键机制，为开发基于HSP70通路的耳聋治疗策略提供理论依据。该模型不仅适用于遗传性耳聋机制研究，还可用于评估药物对毛细胞再生的促进作用，具有重要的转化医学价值。

重要意义
研究首次在脊椎动物模型中系统性解析OTOF基因功能，填补了斑马鱼听觉研究领域空白。发现的HSP70-MAPK调控网络为靶向抗氧化治疗提供新思路，未来可探索通过增强HSP70表达或抑制MAPK信号来延缓耳聋进展。此外，斑马鱼模型的建立将加速听力损伤再生医学研究，推动基因编辑技术在听觉疾病治疗中的应用。