AAA+ ATP酶Thorase新型螺旋纤维结构的冷冻电镜解析及其在mTORC1复合体解聚中的机制研究

本研究通过冷冻电镜技术首次解析了AAA+ ATP酶Thorase在ATP结合状态下形成的螺旋纤维结构（分辨率4.2 ?），揭示了其独特的二聚体重复单元组装模式。研究人员发现Thorase纤维形成依赖ATP结合而非水解，并通过结构引导的突变实验证实关键氨基酸残基对纤维组装及mTORC1复合体解聚的调控作用，为理解神经可塑性和线粒体质量控制提供了新机制。

　　

在细胞生命活动中，AAA+（ATPases associated with diverse cellular activities）ATP酶家族扮演着"分子拆解专家"的角色，它们利用ATP水解能量驱动蛋白质复合体的解聚和重塑。其中，Thorase（又称ATAD1）作为该家族的特殊成员，被发现参与突触可塑性、线粒体质量控制和mTOR信号通路调控。然而，长期以来科学界对其作用机制存在两大谜团：一是其寡聚化形式存在争议——既往研究报道过六聚体或二聚体结构，但生理相关性存疑；二是其解聚AMPAR和mTORC1复合体的结构基础尚未阐明。这些知识缺口严重阻碍了对Thorase在神经系统疾病中作用机制的理解。

为破解这些难题，约翰霍普金斯大学等机构的研究团队在《Computational and Structural Biotechnology Journal》发表了突破性研究成果。研究采用冷冻电镜（cryo-EM）解析Thorase的原子结构，结合生化分析和突变验证，首次揭示了其形成螺旋纤维的能力及其功能意义。关键技术包括：1）截短型Thorase Δ1-40蛋白表达纯化；2）负染电镜筛选纤维形成条件；3）300 kV冷冻电镜数据采集；4）冷冻电镜图像处理和三维重构；5）基于AlphaFold模型的柔性拟合；6）ATP酶活性测定；7）化学交联寡聚化实验；8）mTORC1解聚功能验证。

【3.1 负染电镜分析Thorase纤维形成】
研究人员通过截去N端1-40个疏水氨基酸（避免聚集），获得可溶性Thorase Δ1-40。负染电镜显示，加入ATP-γ-S后60秒即可形成长达数百纳米的纤维，而ATP、AMP-PNP等核苷酸类似物仅能诱导有限组装，提示ATP结合是纤维形成的决定性因素。

【3.2 Thorase纤维的冷冻电镜结构】
冷冻电镜结构解析显示，Thorase纤维呈左手螺旋，直径10 nm，每层由二聚体构成基本重复单元，6个亚基（3层）完成一个螺旋周期（28.4 ?/亚基）。引人注目的是，二聚体界面由E193/D195/D242酸性残基与对侧R199/R201/H206形成静电网络，其中三连丝氨酸（S202-S204）构成"盖子"覆盖ATP-γ-S的γ-磷酸基团。这种界面完全不同于既往报道的Thorase六聚体或酵母同源物Msp1二聚体，代表AAA+ ATP酶的新型组装模式。

【3.3 纤维界面突变分析】
结构引导的突变实验证实界面关键残基的功能：R201A/D195A突变完全破坏纤维形成；R304A导致短纤维聚集；而经典Walker-B突变E193Q则形成六聚体而非纤维。这些结果揭示Thorase具有多形态寡聚化的结构可塑性。

【3.4-3.6 功能验证】
通过化学交联实验发现，野生型Thorase在ATP-γ-S作用下形成高分子量寡聚体，而界面突变体丧失该能力。更重要的是，pull-down实验显示野生型Thorase与mTOR/Raptor的结合强度在ATP-γ-S存在时提升3倍，但突变体无此效应。在mTORC1解聚实验中，野生型Thorase可使复合体解离效率提高4倍，而纤维缺陷突变体此功能显著受损，证明纤维形成与生理功能直接相关。

这项研究首次揭示Thorase通过新型螺旋纤维结构行使功能的分子机制，突破了对AAA+ ATP酶传统环形结构的认知局限。结构分析表明，Thorase的二聚体界面具有独特的构象可塑性，使其能在纤维、六聚体等多种状态间转换，这种特性可能与其在不同细胞区室中的功能多样性相关。特别值得注意的是，E193残基（Walker-B模体关键位点）在纤维界面形成中发挥核心作用，这为理解ATP结合与水解如何调控Thorase的组装与解聚提供了结构基础。

研究还建立了Thorase纤维形成与mTORC1调控的直接关联，为开发针对mTOR信号通路异常相关疾病（如癫痫、神经退行性疾病）的新策略提供了靶点。局限性在于使用的截短蛋白可能不完全反映生理状态，未来需要通过冷冻电子断层扫描（cryo-ET）在细胞原位验证纤维结构。这些发现不仅拓展了对AAA+ ATP酶超家族结构和功能多样性的认识，也为理解蛋白质质量控制与神经疾病的关系开辟了新视角。