CRISPR/Cas12a 驱动的无扩增阻抗生物传感器用于病原细菌 DNA 的检测

传统细菌检测方法耗时且需复杂处理，难适快速诊断。本研究开发 CRISPR/Cas12a 阻抗生物传感器，无扩增检测金黄色葡萄球菌 DNA，检测限低至 20 aM，验证血清样本准确性，为 sepsis 快速检测提供新工具。

　　在细菌感染的诊疗领域，及时且精准的检测宛如照亮迷雾的灯塔，对提升患者预后、降低医疗成本至关重要，尤其是在脓毒症（sepsis）的诊疗中，延迟诊断往往意味着更高的死亡率。然而，传统基于培养和聚合酶链式反应（PCR）的检测方法，如同行动迟缓的老者，不仅耗时漫长，还需要复杂的样本处理流程，在资源有限的场景下，难以满足快速诊断的迫切需求。在此背景下，基于 CRISPR/Cas 系统的检测方法，特别是与电化学传感相结合后，凭借其操作简便、特异性强的优势，宛如一颗冉冉升起的新星，为细菌感染的即时检测（point-of-care, POC）带来了新的希望。

为突破现有检测技术的瓶颈，来自国外研究机构的研究人员开展了一项极具创新性的研究。他们提出了一种基于 CRISPR/Cas12a 系统的无标记阻抗生物传感器，旨在实现对脓毒症主要病原菌之一 —— 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）DNA 的快速、无扩增检测。这项研究成果发表在《Biosensors and Bioelectronics》上，为细菌感染检测领域注入了新的活力。

研究人员在开展此项研究时，主要运用了以下关键技术方法：构建了基于 CRISPR/Cas12a 系统的阻抗生物传感器，利用 Cas12a/crRNA 复合物对目标 DNA 的识别能力，结合目标激活的非特异性 DNA 报告分子的旁切活性（trans-cleavage activity），通过测量金电极表面电荷转移电阻（R_ct）的变化来实现对目标 DNA 的检测，并在人类血清样本中进行了验证。

工作原理与可行性分析

检测原理如图 1a 所示，该无标记电化学传感器基于目标激活的核糖核蛋白（RNP）复合物在金黄色葡萄球菌 DNA 存在下对非特异性 DNA 报告序列的旁切作用。这种现象会导致巯基单链 DNA（SH-ssDNA）修饰电极与电解质界面的电荷转移电阻（R_ct）发生变化，通过电化学阻抗谱（EIS）对其进行测量，从而实现对目标 DNA 的检测。实验证明，CRISPR/Cas12a 系统在该传感器中具有良好的可行性，为后续的检测奠定了基础。

检测性能评估

该生物传感器展现出了超灵敏的检测能力，在缓冲液中无需任何预扩增步骤，对双链 DNA（dsDNA）靶标的检测限低至 20 aM。这一结果表明，该传感器能够检测到极低浓度的目标 DNA，具有极高的灵敏度，为微量病原 DNA 的检测提供了可能。

PAM 序列对检测的影响

研究人员考察了原间隔相邻基序（protospacer adjacent motif, PAM）序列对检测灵敏度和特异性的影响。结果显示，CRISPR 的特异性高度依赖于 PAM 序列，靶序列上的错配会降低切割效率，含 PAM 序列的单碱基错配会导致旁切活性急剧下降。这一发现揭示了 PAM 序列在保证检测特异性中的关键作用，为传感器的特异性设计提供了重要依据。

DNA 报告分子的影响

实验还研究了 DNA 报告分子对检测性能的影响，发现当单链 DNA（ssDNA）靶标与双链 DNA（dsDNA）报告分子配对时，切割效率会降低。这提示在传感器的设计中，需要合理选择 DNA 报告分子的类型，以优化检测性能。

临床样本验证

通过人类血清样本的验证实验，证实了该生物传感器在临床环境中检测细菌 DNA 的准确性。这意味着该传感器不仅在实验室条件下表现出色，在实际的临床应用中也具有可靠的检测能力，为其临床转化提供了有力支持。

结论与讨论

本研究成功构建了一种基于 CRISPR/Cas12a 系统的无标记阻抗生物传感器，用于金黄色葡萄球菌的检测。其检测机制依赖于 Cas12a/crRNA 复合物识别靶标后对固定在金电极上的 DNA 报告分子的旁切作用，从而导致电极表面与电解质中氧化还原探针之间的 R_ct降低。该传感器对 DNA 报告分子的固定和 CRISPR/Cas 反应条件进行了优化，展现出超灵敏、无扩增的检测能力，检测限低至 20 aM，且在人类血清样本中验证了其准确性。

这项研究成果具有多方面的重要意义。从技术层面来看，它开发了一种无需标记、无需扩增的快速检测方法，简化了检测流程，降低了检测成本，为电化学传感器与 CRISPR 技术的结合提供了新的范例。从应用层面而言，该传感器能够在几分钟内检测出血清样本中极低浓度的感染细菌，适用于脓毒症的早期现场诊断，有望在资源有限的地区和紧急医疗场景中发挥重要作用，为降低脓毒症的死亡率、改善患者预后提供有力的技术支持。此外，研究中对 PAM 序列依赖性和 DNA 报告分子影响的探讨，为进一步拓展无标记 CRISPR 诊断在其他病原体检测中的应用奠定了理论基础，拓宽了该技术的应用范围。