三光子显微成像技术实现小鼠内侧前额叶皮层神经元与胶质细胞的深层亚细胞分辨率活体观测

本研究通过开发三光子(3P)显微成像技术，成功突破了传统双光子(2P)成像的深度限制，实现了对小鼠内侧前额叶皮层(mPFC)1700μm深度的神经元、星形胶质细胞Ca2+瞬变和小胶质细胞突触动态的长期活体观测。该技术为研究mPFC在认知功能和精神疾病中的作用提供了革命性工具，相关成果发表于《Communications Biology》。

　　

认知功能的核心中枢——内侧前额叶皮层(mPFC)，一直是神经科学家们孜孜不倦探索的"黑匣子"。这个掌管工作记忆、决策制定和情绪调控的脑区，其深层神经网络的奥秘却长期被技术壁垒所遮蔽。传统双光子显微成像(2P)在穿透深度上捉襟见肘，而植入式GRIN透镜或微棱镜又难免造成组织损伤。更令人扼腕的是，在阿尔茨海默病、精神分裂症等神经精神疾病中，mPFC正是病理变化的关键靶区。如何无创窥探这个"认知司令部"的深层动态，成为领域内亟待突破的技术瓶颈。

德国神经退行性疾病研究中心等机构的研究团队在《Communications Biology》发表突破性成果。他们创新性地将三光子(3P)显微成像技术应用于mPFC研究，通过优化1300-1700nm激发波长、脉冲压缩系统和检测光路，配合特制的水浸物镜，建立了整套深层活体成像方案。研究使用转基因小鼠模型，包括Thy1-YFP-H神经元标记系、Cx3cr1-CreER^T2::Rosa26-tdTomato小胶质细胞报告系等，通过颅窗手术实现长期观测，并采用CaImAn等算法进行钙信号分析。

【Access of the medial prefrontal cortex with 3P-imaging at 1.6mm depth】
研究团队自主搭建的3P显微系统展现出惊人性能：在1300nm激发下，成像深度达1600μm，是2P技术的两倍。信号背景比(SBR)在1000μm深度仍保持稳定，而2P在500μm即急剧衰减。通过优化群延迟色散补偿和14°大角度检测光路，系统成功覆盖mPFC前扣带回、前边缘和下边缘皮层。

【Time-lapse 3P-imaging of dendritic spines in the prelimbic area of the mPFC】
在16月龄Thy1-GFP-M小鼠中，研究人员首次实现基底树突棘(0.41±0.07μm^-1)的周尺度动态追踪。无需自适应光学矫正，即在900-1100μm深度清晰分辨1-2μm的棘突结构，为研究衰老相关的突触可塑性提供新范式。

【Recording microglial fine processes' motility in mPFC】
利用1650nm激发tdTomato标记的小胶质细胞，团队突破性地在1100μm深度测得58.9±2%的突触周转率。连续两日成像显示运动参数稳定，且热休克蛋白检测阴性，证实该技术的低侵袭性优势。

【3P-imaging of astrocytic Ca²⁺-activity in mPFC in vivo】
通过GLAST-CreER^T2::GCaMP5g-tdTomato双标记系统，研究发现深层星形胶质细胞的钙微域活动与表层相似，提示不同皮层层的星形胶质细胞可能具有保守的钙信号特征。

【Imaging Ca²⁺-activity of neurons in the mPFC and dentate gyrus of awake head-fixed mice】
在清醒小鼠中，3P技术成功记录到mPFC第V层谷氨酸能神经元(VGluT2⁺)的钙瞬变(振幅4.95±4.14%ΔF/F)，平均推断放电频率0.33±0.18Hz，为认知行为研究提供新视角。

这项研究标志着深层脑区成像技术的重大飞跃。3P显微技术不仅克服了mPFC研究的深度障碍，其低侵袭特性更支持长期动态观测——这对理解认知疾病的病理机制至关重要。特别值得注意的是，该技术无需侵入性植入物即可实现亚细胞分辨率，为研究神经退行性疾病的突触丢失、小胶质细胞异常激活等过程开辟了新途径。研究者特别指出，在高度髓鞘化的成年小鼠脑区仍能取得优异成像效果，这一突破使得在更接近人类疾病的成年动物模型中开展研究成为可能。随着技术的进一步优化，3P成像有望成为揭示前额叶皮层"深度思维"奥秘的钥匙，为精神疾病和认知障碍研究带来范式变革。