大规模并行报告基因检测与小鼠转基因实验揭示神经元增强子活性的协同互补机制

本研究针对精神疾病相关非编码变体的功能解析难题，创新性整合大规模并行报告基因检测(MPRA)与小鼠转基因实验体系。研究人员通过构建包含5万余个神经元ATAC-seq来源序列的MPRA文库，系统评估了2万余个合成突变和GWAS变体对增强子活性的影响，发现两种方法在神经元增强子活性检测上具有显著相关性（4/5显著MPRA变体在小鼠模型中显示功能改变）。该研究不仅建立了功能性神经元增强子目录，更证实了高通量筛选与体内实验联用的策略价值，为精神疾病遗传机制研究提供了新范式。

　　

在精神疾病遗传学研究领域，全基因组关联分析(GWAS)已鉴定出数百个非编码区风险变异，但这些变异如何影响基因调控仍如"黑箱"。传统方法面临两大困境：高通量的体外实验难以反映体内复杂调控环境，而能提供多组织表型的转基因小鼠实验又受限于通量。这种"鱼与熊掌不可兼得"的现状，严重阻碍了精神疾病遗传机制的解析。

美国劳伦斯伯克利国家实验室联合加州大学的研究团队在《Nature Communications》发表突破性研究。通过巧妙设计"两步验证"策略，首次系统比较了两种主流技术——大规模并行报告基因检测(Massively Parallel Reporter Assays, MPRA)和转基因小鼠模型在神经元增强子研究中的协同效应。研究采用诱导性人类兴奋性神经元模型，构建了覆盖5万多个胎儿神经元ATAC-seq峰和VISTA增强子数据库序列的MPRA文库，包含2.7万个变体（含167个精神疾病GWAS变体）。通过lentiMPRA（慢病毒载体介导的MPRA）和enSERT（CRISPR介导的安全位点整合转基因）技术联用，揭示了两种方法在神经元增强子检测中的高度一致性。

关键技术包括：1) 基于多组学数据（单细胞ATAC-seq、进化保守性等）设计270bp的MPRA元件库；2) 使用WTC11-Ngn2 iPSC分化的兴奋性神经元进行lentiMPRA；3) 通过H11位点定向整合的转基因小鼠胚胎实验；4) 整合ABC模型（Activity-By-Contact）和motifbreakR等生物信息学分析。

MPRA神经元文库构建与验证
研究团队整合5项神经元ATAC-seq数据和1400个VISTA增强子，设计出8.2万个270bp序列（含2.5万个变体）。在iPSC分化的兴奋神经元中，73%序列通过质控（中位活性z-score=0.09）。功能验证显示：与启动子重叠的元件活性最高（z-score=0.32），而编码外显子区域呈现抑制效应（z-score=-0.15）。转录因子 motif 分析发现激活元件富集神经元特异的RFX、LHX家族，证实了检测体系的生物学特异性。

表观遗传信号关联分析
通过整合740个表观基因组数据集，发现MPRA活性与神经组织开放染色质信号显著相关。在排除启动子区域后，脑组织样本的富集强度比非神经组织高3倍（p<0.001）。特别值得注意的是，NGN2神经元分化时间序列的ATAC信号与MPRA活性动态变化高度同步，证实了模型的时间特异性。

跨物种增强子活性关联
建立广义线性模型(GLM)分析显示：MPRA活性可显著预测小鼠转基因实验的神经组织表达（Nagelkerke R²=0.21，p=2×10^-5）。验证实验中，模型预测86%活性的6个元件，5个（83%）在小鼠胚胎确实显示神经管/脑区表达。这种跨物种相关性在独立MPRA数据集中得到重复，表明发现具有普适性。

精神疾病变体功能解析
在167个GWAS变体中，7个（4.2%）显著改变MPRA活性，对应11个精神疾病风险位点。其中hs978.1变体破坏POU4F3结合位点（预测得分下降2.4），在小鼠模型中导致三叉神经节表达缺失。引人注目的是，4/5合成变体在两种体系中表型一致，包括调控MEF2C（神经发育关键基因）的增强子变体。

该研究建立了迄今最全面的功能性神经元增强子目录，证实MPRA可作为转基因实验的高效预筛工具。特别重要的是，发现约5%的精神疾病GWAS变体具有调控功能，且这些变体多位于神经发育基因（如GRIN2A、CTNND1）的增强子区。方法学上，研究首次证明270bp短片段在跨体系检测中的可靠性，为高通量筛选提供了新标准。这些发现不仅推进了对精神疾病遗传架构的理解，更建立了"体外高通量筛选→体内精细验证"的研究范式，为复杂疾病非编码变体的功能解析提供了模板。