III型关联Cas6蛋白在嗜热栖热菌中作为I-B型CRISPR-Cas系统的负调控因子

研究人员针对多CRISPR-Cas系统宿主中Cas6蛋白的共现与交叉切割功能机制不明的问题，揭示了嗜热栖热菌HB27中III型关联Cas6-2通过竞争性组装I-B型Cascade复合体抑制其干扰活性的新机制，为多系统功能耦合与调控提供了关键见解。

　　

论文解读

研究背景与意义

CRISPR-Cas（成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白）是原核生物中由RNA引导的适应性免疫系统，通过crRNA（CRISPR RNA）介导的序列特异性切割抵御外源遗传元件入侵。尽管I型和III型CRISPR-Cas系统在进化上关系密切且常共现于同一宿主，但多系统中Cas6蛋白的交叉切割活性及其调控机制仍不明确。嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）HB27作为极端嗜热菌模型，携带I-B、I-C、III-A和III-B四种CRISPR-Cas亚型，为探究多系统互作提供了理想平台。

研究方法

研究人员通过构建基因缺失株（如ΔI-B、Δcas6-1等）、体外酶切实验（5'-FAM标记重复序列分析）、GST pull-down（蛋白互作检测）、Cascade复合体纯化与质谱鉴定、转录组测序及高通量crRNA测序等技术，系统评估了Cas6-1和Cas6-2的切割特异性、复合体组装功能及调控机制。

研究结果

1. CRISPR阵列的亚型特异性
通过质粒干扰实验发现，HB27的11个CRISPR阵列严格区分于不同亚型：含Repeat-1的阵列仅激活III-A/B系统，Repeat-2和Repeat-3分别特异性服务于I-C和I-B系统（图1d-f）。

2. III型系统对多拷贝靶标的高效防御
III型系统对染色体和质粒靶标均表现出强干扰活性，而I-B/I-C系统仅有效切割低拷贝基因组靶标（图1g）。qPCR证实质粒拷贝数约为基因组的2倍（图1h），提示I型系统对高拷贝靶标的低效性可能源于剂量效应。

3. Cas6-2抑制I-B系统干扰活性
基因缺失实验表明，Cas6-2缺失（Δcas6-2）显著增强I-B系统对质粒的清除能力（图3c）。互补实验进一步证实，Cas6-2通过竞争性结合Cas5b_I-B（I-B型Cas5亚基）参与组装非功能性Cascade复合体，从而抑制I-B系统活性（图4b-c, 图5d）。

4. Cas6-1的交叉利用潜能
在Cas6-2缺失背景下，Cas6-1可替代Cas6-2为III型系统提供crRNA（图3g-i），但天然表达水平下Cas6-1优先被I-B系统占用（补充图10）。

5. Cascade复合体的功能差异
质谱分析显示，野生型Cascade复合体含Cas6-1和Cas6-2，而Δcas6-1株复合体仅含Cas6-2（补充数据3）。体外切割实验证实，Cas6-2组装的复合体丧失靶DNA切割能力（图5h-j）。

结论与意义

本研究首次揭示III型关联Cas6-2作为I-B系统的内源性负调控因子，通过竞争性组装非功能性Cascade复合体抑制其干扰活性（图6）。这一发现阐明了多CRISPR-Cas系统间的功能耦合机制，为理解Cas6在动态复合体组装中的核心作用提供了新视角，也为优化I-B型基因编辑工具（如调控Cas6-2表达）提供了理论依据。研究发表于《Communications Biology》，得到中国国家重点研发计划（2022YFA0912200）等资助支持。