基于微流控细胞轨迹调制技术的CAR-T细胞功能表型快速生物物理分析新方法

为解决CAR-T细胞治疗中批次间功能表型差异大、传统检测耗时长且破坏样本的问题，研究人员开发了基于微流控的细胞轨迹调制(CTM)技术，通过分析细胞尺寸和变形性等生物物理特征，在10分钟内完成<10,000个细胞的表型评估。该技术揭示了生物反应器类型对CAR-T细胞特性的影响，并与细胞毒性活性显著相关，为细胞治疗产品的实时质控提供了新工具。

　　

在癌症免疫治疗领域，CAR-T细胞疗法已成为血液系统恶性肿瘤的革命性手段，但高昂的成本（每批次高达50万美元）和9%的批次失败率始终困扰着临床转化。更棘手的是，现有流式细胞术等检测方法需要标记处理、耗时长，无法在制造过程中实时监控细胞状态，导致产品最终疗效存在巨大波动。这种"黑箱"式生产模式使得CAR-T细胞在冷冻保存、运输和解冻后的功能变化成为未知数，直接影响患者治疗效果。

为突破这一瓶颈，新加坡-麻省理工学院科研联盟和新加坡科技研究局的研究团队创新性地开发了细胞轨迹调制(CTM)技术。这项发表于《Nature Communications》的研究利用微流控芯片中的不对称微柱阵列，通过调节流速诱导细胞产生特征性运动轨迹，从而在10分钟内无标记地获取T细胞的尺寸和变形性等生物物理参数。研究团队采用健康供体和淋巴瘤患者的PBMC样本，在G-Rex和Breez两种生物反应器中培养抗CD19 CAR-T细胞，结合定量相位成像、流式细胞术和体外杀伤实验进行系统验证。

CTM assay profiles T cell biophysical features
通过优化微柱结构设计，研究实现了6-12μm范围内细胞尺寸的精确测量。设备在-50mBar（低速）和-500mBar（高速）压力下运行，分别捕获细胞尺寸(H1/H2)和变形性(H3/H4)特征，88个转化特征通过PCA降维构建生物物理指数。

Distinct T cell biophysical states in the CTM assay
实验显示CD3/CD28激活24小时的T细胞尺寸分布呈现多峰特征，而10% DMSO处理15分钟即导致变形性显著降低（p<0.0001）。无监督聚类分析将未刺激、激活和DMSO处理细胞明确区分，PCA分析解释率达44%。

Biophysical signatures in cell cultures comparable to flow cytometry forward scatter plots
在14天培养周期中，CTM的H4变形性参数与流式前向散射(FSC)高度相关（r=0.89, p<0.0001），证实其可替代传统尺寸检测。定量相位成像显示细胞形态变化与CTM特征同步波动。

CAR T biophysical signatures distinguish CAR T from different bioreactors
来自3名供体的CAR-T细胞在Breez灌注式反应器和G-Rex静态培养中显示出23.9%的CTM特征差异，其中Breez培养细胞呈现更高的CD127⁺表达（p<0.01）和独特生物物理特征。

CTM biophysical features correlate with CAR T potency and cytokine profiles
关键发现是变形性特征D21与NALM6细胞杀伤效率呈强相关（r=0.95），而S5特征在两种反应器中均保持稳定相关性。细胞因子分析显示IL-5/IL-13与CTM特征正相关，暗示Th2反应通路参与。

Aggregated CAR T cell linear biophysical indexing
生物物理指数成功区分Breez（0.91±1.17）和G-Rex（-1.39±0.77）产品（p<0.0001），且患者与健康供体CAR-T细胞无显著差异，证实技术适用于临床样本。

这项研究开创性地建立了CAR-T细胞生物物理特征与功能表型的映射关系，其核心价值在于：首次实现制造过程中细胞功能的实时、无损评估；揭示生物反应器类型会显著改变细胞力学特性；提供比IFN-γ分泌试验更直接的效力预测指标。该技术仅需20μL样本和标准显微镜配置的特性，使其非常适合整合到自动化生产线中，为下一代个体化细胞治疗的"智能工厂"奠定技术基础。尤其值得注意的是，CTM检测到的变形性变化可能反映细胞迁移能力，这为理解CAR-T体内归巢效率提供了新视角。未来研究可进一步探索力学特征与表观遗传调控的关系，以及如何利用这些参数优化冷冻保存方案。