人神经祖细胞外泌体递送miR-100-5p靶向NOX4 mRNA缓解急性缺血损伤中的氧化应激

本研究针对急性缺血性卒中(AIS)中NADPH氧化酶4(NOX4)介导的氧化应激损伤，通过高通量测序筛选出hNPC(人神经祖细胞)来源外泌体中富含的miR-100-5p。研究人员采用电穿孔技术将外泌体载药，在OGD/R(氧糖剥夺/复氧)模型和MCAO(大脑中动脉闭塞)小鼠中证实其可通过抑制NOX4表达降低ROS水平，减小梗死面积并改善神经功能，为缺血性卒中治疗提供了新型纳米递送策略。

　　

急性缺血性卒中作为全球致残和致死的主要原因，其治疗面临两大核心矛盾：及时恢复血流的必要性，以及随之加重的缺血再灌注损伤(I/R injury)。这种损伤的核心机制是NADPH氧化酶4(NOX4)过度表达引发的活性氧(ROS)爆发，它不仅抑制血管新生，还会破坏血脑屏障(BBB)的完整性。尽管已有研究证实NOX4基因敲除可减轻脑损伤，但如何精准调控脑血管内皮细胞的NOX4表达仍是未解难题。

浙江大学医学院附属第一医院等机构的研究团队在《Molecular Neurobiology》发表的研究中，创新性地利用人神经祖细胞(hNPC)来源的外泌体作为天然载体，通过电穿孔技术装载miR-100-5p，成功实现了对脑血管内皮细胞NOX4的靶向调控。该研究不仅揭示了miR-100-5p-NOX4轴在缺血损伤中的关键作用，更开发了一种具有临床转化潜力的纳米递送系统。

研究主要采用四大技术方法：(1)从iPSC诱导的hNPC中分离鉴定外泌体(NTA和TEM表征)；(2)高通量测序结合miRDB数据库筛选靶向NOX4的miRNA；(3)电穿孔技术实现外泌体miR-100-5p高效装载；(4)建立OGD/R细胞模型和MCAO动物模型验证治疗效果。

研究结果
hNPC来源外泌体及miRNA测序特征
通过超速离心法分离的外泌体呈现典型杯状形态(50-150nm)，Western blot检测到CD63、TSG101标志蛋白。miRNA测序发现外泌体中let-7家族和miR-100-5p含量丰富，生物信息学分析显示miR-100-5p是唯一同时位列表达量前十且能靶向NOX4 mRNA的miRNA。

OGD/R诱导的氧化应激模型建立
在bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞中，2小时氧糖剥夺加2小时复氧(OGD/R)可显著上调NOX4表达(蛋白水平增加3倍)，使ROS升高4倍，细胞凋亡率增加至50%。该模型成功模拟了临床缺血再灌注损伤的核心特征。

miR-100-5p的调控机制验证
在三种候选miRNA(miR-92b-3p、miR-423-5p、miR-100-5p)中，miR-100-5p mimics转染使NOX4 mRNA降低60%，蛋白表达下降55%。流式细胞术证实其可使OGD/R处理的细胞ROS水平恢复至近正常水平，显著优于其他miRNA。

外泌体递送系统的治疗效果
DiI标记实验证实hNPC外泌体可被bEND.3细胞有效摄取。载药外泌体治疗使OGD/R模型凋亡率降低50%，细胞活力恢复80%。在MCAO小鼠中，外泌体-miR-100-5p组较空白对照组梗死体积减小75%，改良神经功能缺损评分(mNSS)改善率达68%，且效果显著优于单纯外泌体治疗组。

讨论与意义
该研究首次揭示hNPC外泌体天然携带的miR-100-5p具有双重优势：既保留干细胞来源外泌体的天然靶向性，又通过精确调控NOX4实现ROS清除。相较于传统抗氧化疗法，这种基于外泌体的递送系统能穿透血脑屏障，且避免全身给药的脱靶效应。

值得注意的是，研究发现单纯hNPC外泌体即具有一定神经保护作用，提示其可能通过let-7等其他miRNA协同发挥作用。这为开发多靶点组合疗法提供了新思路。研究建立的"电穿孔载药-外泌体递送"技术体系，不仅适用于缺血性卒中，也为其他脑血管疾病和神经退行性病变的治疗提供了普适性技术平台。

未来研究可进一步优化外泌体产量和载药效率，探索冻干保存等临床转化方案。该成果为开发无细胞治疗的精准医学方案奠定了坚实基础，有望突破当前缺血性卒中治疗的时间窗限制。