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为探究 TAR 方法在昆虫病毒基因组工程研究中的适用性，研究人员以杀虫病毒 HvAV-3h 的 dsDNA 基因组为模板，通过三轮 TAR 循环组装出 >44.6 Kb 的长 DNA 片段，测序显示与参考株高度一致，为病毒基因功能研究奠定基础。
在生命科学领域，合成生物学的兴起为病毒研究带来了全新视角。尤其是面对具有巨大基因组的病毒时，如何高效组装长链 DNA 成为关键挑战。昆虫病毒中，如 ascovirus（无包涵体病毒）这类属于核质大 DNA 病毒（NCLDVs）的成员，其基因组通常超过 100 Kb，传统体外组装方法因 DNA 分子量大、易断裂且成本高昂而难以施展，而 TAR（Transformation-Associated Recombination，转化关联重组）方法虽在人类和动物病毒长片段组装中展现潜力，但在昆虫病毒中的应用却极为有限。在此背景下，探究 TAR 方法对昆虫病毒长 DNA 片段的组装能力，对于深入开展这类病毒的基因组工程研究显得尤为迫切。
为解决这一问题，来自埃及亚历山大大学、中国湖南农业大学等机构的研究人员，针对 Heliothis virescens ascovirus 3h（HvAV-3h）这一昆虫病毒开展研究。他们希望通过 TAR 方法构建其长 DNA 片段，以评估该方法在 ascovirus 所属病毒家族基因组工程中的适用性。研究成果发表在《BMC Biotechnology》。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先通过 PCR 技术从 HvAV-3h 基因组中扩增出 15 个约 2.9–3.2 Kb 的小片段；然后利用酵母细胞的 TAR 系统，分三轮进行重组，先将小片段组装成三个约 15 Kb 的中等大小片段，最后再组装成约 44.6 Kb 的长 DNA 片段；通过菌落 PCR、限制性酶切分析筛选阳性克隆，并运用下一代测序（NGS）技术对组装片段进行质量评估。
长 DNA 片段的组装过程及验证
研究人员按照精心设计的流程进行长 DNA 片段组装。首轮通过 PCR 合成 15 个带有重叠序列的小片段，重叠长度在 114–252 bp 之间，以便于在酵母细胞中进行同源重组。随后，将这些小片段与线性化的 pGF 载体（一种细菌人工染色体 / 酵母人工染色体穿梭载体）共转化到酵母 spheroplasts（原生质体）中，通过三轮平行的 TAR 循环，成功获得三个约 15 Kb 的中等大小片段。最后一轮 TAR 循环则将这三个中等片段组装成目标长 DNA 片段。通过菌落 PCR 检测，使用多组引物验证了片段间连接的正确性，限制性酶切分析显示组装片段的酶切模式与计算机模拟预测高度吻合，初步证明了组装的成功。
组装片段的序列分析与突变研究
对组装的长 DNA 片段进行 NGS 测序，并与野生型 HvAV-3h 基因组相应区域（96,478–141,151 核苷酸）进行比对，结果显示序列一致性达 97.3%。进一步分析发现，组装片段中存在一个包含 bro-like 基因、小假设蛋白基因和烟酰胺核苷酸焦磷酸化酶基因的缺失区域，该区域在不同 HvAV 菌株中本身就存在显著变异。同时，检测到三个特异性核苷酸突变，且这些突变在中等大小片段的 Sanger 测序和长片段的 NGS 数据中表现一致，表明这些突变和缺失很可能在初始合成阶段就已存在，而非 TAR 过程引入。与其他 HvAV 菌株的 BLAST 比对显示，不同突变区域与不同菌株具有较高的序列一致性，提示病毒在不同宿主中的传播可能导致了这些变异的积累。
TAR 方法的优势与面临的挑战
TAR 方法在此次研究中展现出显著优势。其借助酵母细胞高效的同源重组能力，无需依赖体外酶促反应，即可实现长 DNA 片段的无缝连接，且成本相对较低，具备规模化合成完整病毒基因组的潜力。然而，研究也发现随着质粒大小的增加，大肠杆菌的转化效率明显下降，这可能与大质粒在细菌中的复制和稳定性问题有关。此外，尽管 TAR 本身并非突变的主要来源，但模板病毒 DNA 在不同宿主中的传代以及 PCR 扩增过程都可能导致突变的产生，这提示在未来研究中需进一步优化模板制备和扩增策略，以减少突变的影响。
综上所述，本研究成功利用 TAR 方法在酵母细胞中组装出 HvAV-3h 的长 DNA 片段，验证了该方法在昆虫病毒基因组工程中的有效性。这一成果为 ascovirus 及其他 NCLDVs 的全基因组合成奠定了基础，将极大推动昆虫病毒基因功能、病毒与宿主相互作用等领域的研究。通过对病毒基因组的精准操作，有望深入揭示这类复杂病毒的复制机制、致病原理，并为开发新型生物杀虫剂、病毒载体及抗病毒策略提供关键技术支持。研究中所建立的技术流程和发现的问题，也为后续合成生物学在大基因组病毒研究中的应用提供了重要参考，展现了跨学科技术在破解生命科学难题中的强大力量。
