综述：技术进步推动毕赤酵母成为可持续生物制造的下一代平台

这篇综述系统阐述了甲基营养型酵母Komagataella phaffii（K. phaffii）如何通过CRISPR基因编辑、AI代谢模型（GSMM）和微流控高通量筛选等技术升级，从传统蛋白表达载体转型为智能生物制造底盘，利用甲醇（C1）底物实现低碳循环经济，在重组蛋白（如AOX1启动子调控系统）、高值化学品（脂肪酸/萜类）合成等领域展现突破性潜力。

　　

CRISPR赋能的基因组编辑革命
CRISPR-Cas系统彻底改变了毕赤酵母的基因操作范式。从化脓链球菌Cas9到新型效应蛋白Cas12/Cas13，编辑工具库的扩展使多基因修饰效率显著提升。与传统同源重组相比，结合微流控液滴分选技术，编辑精度提高的同时将"设计-构建-测试-学习"周期压缩80%。近期研究更通过改造CRISPR-Cas12f变体，实现<2 kb的紧凑型编辑系统在K. phaffii中的高效递送。

模型驱动的代谢通路重编程
第二代基因组测序与多组学分析揭示了K. phaffii代谢网络的全景图谱。AI增强的基因组尺度代谢模型（GEM）可动态模拟碳流分布，例如在脂肪酸合成中，通过平衡甲醛氧化（FAD依赖的AOX途径）与乙酰-CoA节点通量，使产量提升4.3倍。机器学习算法进一步优化了甲酸脱氢酶（FDH）与核糖体结合位点（RBS）的适配性，实现甲醇到萜类化合物的转化效率突破理论值的72%。

高效甲醇转化营养物质的强化策略
在单细胞蛋白（SCP）生产中，K. phaffii的甲醛同化路径（二羟基丙酮合成酶-DAS）被重新设计。通过引入大肠杆菌的RuBisCO酶与工程化五磷酸核酮糖（Ru5P）再生循环，碳损失减少38%。最新研究还利用CRISPR激活（CRISPRa）上调FGH1基因（甲醛脱氢酶），使菌体蛋白含量达到细胞干重的63%。

未来挑战与前景
尽管K. phaffii已展现出超越酿酒酵母的工业潜力，但辅因子调控（如NAD⁺/NADH平衡）和规模化培养仍是瓶颈。正在开发的电催化-发酵耦合系统有望将甲醇转化率提升至0.5 g/g。随着DNA合成机器人的普及，自主进化平台或将实现每周10⁶次突变筛选，加速推进该酵母成为碳中和制造的全球标准平台。