3D生物打印载干细胞微纤维支架联合三细胞共培养及二甲双胍双阶段释放系统促进大鼠骨/血管/神经协同再生

本研究针对临界骨缺损修复中血管神经再生不足的临床难题，创新性构建了3D生物打印藻酸盐微纤维（aMF）-磷酸钙骨水泥（CPC）复合支架，搭载人牙周膜干细胞（hPDLSCs）、脐静脉内皮细胞（hUVECs）和周细胞（PCs）的三细胞共培养体系，并设计二甲双胍（MET）双阶段控释系统。实验证实该支架使大鼠颅骨缺损区新生骨量提升2.5倍，血管和神经再生分别增加3倍和3.5倍，TRIM26基因可能通过cAMP-MAPK通路调控再生过程，为复合组织再生提供了新策略。

　　

临界骨缺损修复一直是临床面临的重大挑战，单纯促进成骨犹如"单腿走路"——缺乏血管网络的"营养通道"和神经支配的"调控系统"，再生的骨骼往往成为"无源之水"。传统组织工程支架要么像"独奏乐器"仅关注骨再生，要么如"短效药物"无法维持生长因子的持续释放。更棘手的是，血管和神经再生需要复杂的"细胞交响乐"，而现有技术难以模拟这种动态交互。北京口腔医院的研究团队在《Bioactive Materials》发表的突破性研究，犹如为这场再生医学音乐会谱写了全新乐章。

研究团队采用3D生物打印（FRESH技术）构建氧化藻酸盐微纤维（aMF），结合磷酸钙骨水泥（CPC）形成双阶段释放支架；通过流式细胞术筛选hPDLSCs，与hUVECs和PCs按4:12:1比例共培养；利用Micro-CT、免疫荧光和RNA测序等技术评估再生效果；采用Western blot验证TRIM26基因功能。实验使用SD大鼠双侧颅骨缺损模型（5mm直径），样本量每组n=4。

3.1 支架设计与制备
创新性采用FRESH技术打印含7.5%氧化藻酸盐的200μm微纤维，SEM显示降解形成的100-300μm大孔道（图2G），为细胞延伸提供空间。CPC的FTIR和原子力显微镜证实PO₄^3-结构（图2H-I），力学测试显示其抗弯强度（15MPa）优于松质骨（图2J）。

3.2 双阶段释放系统
CPC在1-4天快速释放MET建立微环境（阶段一），aMF在4-12天缓释MET并释放细胞（阶段二）。HPLC检测显示两阶段MET释放曲线完美衔接（图2M），pH值稳定在7.2-7.4（图2O），CCK-8证实三细胞存活率>90%（图2N）。

3.3 三细胞协同效应
hPDLSCs（CD90⁺）与PECAM1⁺的hUVECs、Desmin⁺的PCs共培养时，形成密集的毛细血管样结构（图3F）。200mg/mL MET使ALP活性提升2倍（图4E），最佳比例组（4:12:1）的矿化结节面积增加3.5倍（图4G）。

3.5 体内骨再生
Micro-CT显示实验组（三细胞+MET）BV/TV值达45%，是对照组的2.5倍（图5C）。Masson染色显示成熟骨胶原纤维有序排列（图5E），IL-1β表达降低60%（图5G）。

3.6 血管神经再生
CD31⁺血管密度增加20倍（图6B），CGRP⁺神经纤维与新生血管伴行（图7A）。RNA测序发现TRIM26表达上调4.8倍（图8H），Western blot证实其通过激活Runx2和MAPK促进再生（图8J）。

这项研究开创性地将"时空控释"与"多细胞交响"理念相结合。双阶段MET释放犹如"精准灌溉系统"，先营造再生微环境，再输送细胞"施工队"；三细胞共培养则像"联合施工团队"，hPDLSCs作为"建筑师"分泌基质，hUVECs和PCs形成"输水管网"。特别值得注意的是，TRIM26可能是调控"神经-血管-骨"三位一体再生的"总指挥"，这为理解组织再生提供了新视角。该技术未来在颌骨缺损修复中具有重要转化价值，但需解决三细胞规模化培养的成本问题。正如研究者所言："真正的再生不是简单填补空缺，而是重建具有生命力的功能单元。"这项研究正是朝着这个目标迈出的关键一步。