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在异质细胞群体中分离特定表型克隆颇具挑战。为此，研究人员开发多界遗传条形码系统 CloneSelect，利用 CRISPR 碱基编辑触发目标克隆表达报告基因以实现分离。该系统在多物种中表现高效，为解析克隆异质性等提供新工具。
在生命科学研究中，解析复杂细胞群体中的克隆动态与功能异质性是关键挑战。无论是癌症化疗中耐药克隆的起源，还是干细胞分化时的命运决定机制，精准分离特定表型或基因型的克隆都是解开这些谜题的核心。然而，传统方法如流式细胞术依赖表型标记，难以在克隆未显型时追踪，而基于 CRISPR-Cas9 的回溯性克隆分离技术又存在脱靶效应、细胞毒性或效率不足等问题，限制了其在多物种中的应用。
为突破这些瓶颈，加拿大英属哥伦比亚大学（The University of British Columbia）等机构的研究人员开展了一项创新性研究。他们开发了一种名为 CloneSelect 的多界遗传条形码系统，利用 CRISPR 碱基编辑技术实现目标克隆的精准分离。相关成果发表在《Nature Biotechnology》上，为细胞克隆研究提供了跨物种的通用工具。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：
- 遗传条形码标记：通过慢病毒转导将 DNA 条形码稳定整合到细胞基因组，标记单个细胞。
- CRISPR 碱基编辑激活报告基因：利用 C→T（如 Target-AID）或 A→G（如 ABE-7.10）碱基编辑器，在条形码特异性 gRNA 引导下，修复受损的起始密码子或移除上游终止密码子，激活报告基因（如 EGFP、mCherry）表达。
- 单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）兼容平台：开发 scCloneSelect，结合双条形码（uptag 和 dntag）实现克隆转录组与基因型的关联。
- 多物种验证：在人类胚胎肾细胞（HEK293T）、小鼠胚胎干细胞（mESCs）、人类多能干细胞（hPSCs）、酵母和大肠杆菌中验证系统有效性。
研究结果
1. CloneSelect 的高效性与特异性
在哺乳动物细胞中，CloneSelect C→T 和 A→G 系统均表现出高编辑效率与特异性。例如，在 HEK293T 细胞中，与 CRISPRa 系统（如 CaTCH、ClonMapper）相比，其真阳性率更高（10.05–24.88% vs. 6.84–12.50%），且假阳性率显著降低。碱基编辑的精准性避免了传统 CRISPR-Cas9 的随机切割毒性，在复杂群体（如包含 10,000 个条形码的 Pool-10000）中，仍能富集目标克隆至 25% 以上丰度，分离效率优于其他系统。
2. 跨物种的广泛适用性
- 酵母（Saccharomyces cerevisiae）：利用 Target-AID-UGI 融合蛋白增强 C→T 编辑纯度，成功从 1,580 个克隆的群体中分离稀有克隆，编辑效率达 81.51–97.20%。
- 大肠杆菌（E. coli）：通过 A→G 碱基编辑将终止密码子 TAA 转化为 CAA，结合 Zeocin 抗性筛选，从 15,500 个克隆中分离目标克隆，最低可检测到 0.00089% 丰度的克隆。
3. 干细胞研究中的应用
在小鼠 ES 细胞和人类 PS 细胞中，scCloneSelect 结合 scRNA-seq 成功回溯性分离特定转录组特征的克隆。例如，在人类 PS 细胞向 naive 状态诱导过程中，分离出高诱导效率的 “精英克隆”，其表观遗传特征（如 CSAG1 启动子高甲基化）与诱导潜能相关，揭示了克隆异质性的分子基础。
4. 机制与验证
通过全基因组甲基化测序（EM-seq）和 RNA-seq 分析，发现精英克隆的 naive 诱导潜能与 X 染色体上 CSAG1-MAGEA 基因簇的表观调控相关。此外，系统在 DNA 组装和微生物进化研究中也展示了潜力，如从低效组装产物中富集目标 DNA 序列。
结论与意义
CloneSelect 通过碱基编辑与遗传条形码的结合，实现了跨多界物种（哺乳动物、酵母、细菌）的精准克隆分离，解决了传统技术在效率、特异性和物种通用性上的局限。其核心优势在于利用遗传密码的精准修改，避免了传统 CRISPR 技术的脱靶和毒性问题，同时兼容单细胞测序等前沿技术，为解析克隆异质性、干细胞命运决定、癌症克隆进化等领域提供了强大工具。该系统不仅推动基础生物学研究，还在细胞治疗、合成生物学和基因编辑应用中具有广泛前景，例如高效筛选具有特定治疗潜力的干细胞克隆或优化微生物工程菌株。随着技术的进一步优化，CloneSelect 有望成为生命科学研究中解析复杂生物系统的标配工具。
