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为解析细胞异质性起源及传播机制，研究人员开展多代单细胞追踪研究，利用 CRISPR 编辑结合活细胞成像，发现致癌扰动诱导姐妹细胞不对称及表型异质性，揭示复制应激与多倍体化新机制，为癌症早期研究提供框架。
细胞作为生命的基本单位，其个体间的差异 —— 细胞异质性，长期以来困扰着科学家。这种异质性在癌症中尤为突出，表现为肿瘤内细胞在基因、表型和对治疗反应上的显著差异，严重阻碍了精准医疗的发展。尽管已知基因突变和表观遗传变化是重要因素，但细胞异质性如何在多代细胞分裂中产生和传播，尤其是致癌环境下的动态过程，一直缺乏动态追踪的研究手段。传统的基因组分析只能提供群体平均数据，难以捕捉单细胞层面的动态变化，因此亟需一种能够在单细胞水平追踪多代细胞命运的技术，以揭示细胞异质性的起源和遗传规律。
瑞士苏黎世大学的研究人员针对这一科学难题，开展了一项具有突破性的研究。他们利用内源性蛋白标记结合定制计算工具，实现了对多代单细胞的动态追踪，并将研究成果发表在《Nature》上。该研究通过多代细胞谱系分析，首次在单细胞分辨率下揭示了致癌扰动如何诱导姐妹细胞不对称和表型异质性，为理解癌症发展早期事件提供了关键 insights。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，利用 CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑技术，在 U-2 OS 和 RPE-1 细胞中内源性标记 DNA 复制因子 PCNA 和 DNA 损伤标记蛋白 53BP1，分别融合荧光蛋白 mEmerald 和 mScarlet-I，实现了对 DNA 复制模式和遗传性 DNA 损伤的实时追踪。其次，结合活细胞成像技术，对异步生长的细胞进行长达 72 小时的多代追踪，构建细胞谱系树，记录细胞周期阶段和损伤标记的动态变化。此外，通过迭代染色的终点测量（Live+QIBC），同步分析细胞周期和 DNA 损伤标记（如 γH2AX、pRb、p53、p21）的蛋白水平，实现了时间分辨的谱系分析与分子表型的关联。最后，单细胞转录组测序（scRNA-seq）被用于解析异质性的转录基础，揭示基因表达的细胞间差异。
研究结果
追踪复制与 DNA 损伤的动态传递
通过内源性标记的 53BP1 和 PCNA，研究人员发现正常细胞中，53BP1 标记的内源性 DNA 损伤主要在 G1 期出现，并在进入 S 期后清除。而在低剂量 aphidicolin（APH）诱导的轻度复制应激下，53BP1 焦点不仅在 G1 期形成，还在 S 期持续存在；抑制 ATR 激酶则导致更严重的复制扰动和分裂后基因组损伤增加。结合迭代染色技术，证实复制应激会导致 γH2AX、p53、p21 水平升高，pRb 降低，表明细胞周期检查点被激活。这些结果揭示了复制应激诱导的损伤如何跨代传递并影响后代细胞的周期进程。
姐妹细胞异质性的起源
在多代追踪中，未受干扰的细胞显示出清晰的细胞周期转换，而经 APH 或 ATR 抑制剂（ATRi）处理的细胞，其后代出现显著的姐妹细胞异质性。例如，G2 期处理 APH 的细胞，其孙代细胞表现出 γH2AX 和 p53 水平升高，部分细胞因高 p21 和低 pRb 而停滞于 S 期入口。ATRi 处理则导致姐妹细胞在 S 期持续时间和 DNA 损伤积累上的显著差异。单细胞转录组分析显示，DNA 损伤响应基因（如 CDKN1A、FAS、GADD45A）的表达异质性增加，且细胞周期调控基因是异质性的主要驱动因素。此外，53BP1 的核浓度限制了其焦点形成，细胞间 53BP1 水平的差异直接影响对 DNA 损伤的响应，进一步加剧了异质性。
急性 DNA 损伤的跨代效应
通过电离辐射（IR）诱导急性 DNA 损伤，研究发现 G1 期损伤会导致子代细胞在分裂后出现 53BP1 焦点增加，且姐妹细胞间的异质性显著升高。利用可诱导双链断裂的 DIvA 细胞系，证实修复后的 DNA 损伤仍会留下 “染色质疤痕”，导致下一代细胞的复制 timing 异常和损伤积累。这种效应在 p53 缺失的 RPE-1 细胞中更为明显，表明 p53 通路在缓冲异质性中起重要作用。
多倍体化的两条分子路径
研究发现，抑制 NEDD8 激活酶（NAE）的 pevonedistat 可诱导两种不同的多倍体化路径：再复制（rereplication）和核内复制（endoreplication）。再复制导致更高的 DNA 损伤标记（如 γH2AX、p53），而核内复制则与 G2/M 检查点缺陷相关。致癌基因 HRAS 和 cyclin E1 的过表达同样诱导这两种路径，且与复制应激和染色体不稳定密切相关。单细胞谱系分析显示，多倍体细胞可通过多轮分裂维持异质性，其转录特征富集于细胞周期调控和染色体分离相关基因，提示多倍体化是癌症表型可塑性的重要来源。
结论与意义
这项研究通过多代单细胞追踪技术，首次在时空维度上解析了细胞异质性的起源和传播机制，揭示了复制应激和 DNA 损伤如何通过跨代传递的 “表观遗传疤痕” 诱导姐妹细胞不对称，并确定了多倍体化的两条分子路径及其对基因组稳定性的不同影响。研究发现，53BP1 等损伤标记的动态行为不仅是损伤修复的标志，更是异质性传播的关键因子，其浓度和相分离特性直接调控损伤响应的细胞间差异。此外，致癌基因诱导的复制应激通过促进多倍体化和异质性，可能加速癌症进化，为理解肿瘤早期克隆多样性提供了新视角。
该研究的重要意义在于建立了单细胞水平解析表型可塑性的研究框架，填补了传统群体分析的空白。其发现不仅深化了对细胞异质性机制的理解，还为靶向复制应激和多倍体化的癌症治疗策略提供了理论依据，例如通过调控 53BP1 功能或阻断异常复制路径来抑制肿瘤异质性的产生。未来研究可进一步探索这些机制在体内肿瘤模型中的作用，为开发更有效的癌症预防和治疗手段奠定基础。
