CRISPR激活系统在集胞藻PCC 6803中的开发与应用：靶向基因上调促进生物燃料合成

研究人员针对蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803遗传工具匮乏的问题，开发了一种基于dCas12a-SoxS融合蛋白的CRISPR激活（CRISPRa）系统，通过诱导靶向基因上调显著提高了异丁醇（IB）和3-甲基-1-丁醇（3M1B）的产量。该研究不仅实现了多基因协同调控（最高6倍增产），还揭示了代谢通路的复杂调控机制，为光合微生物的代谢工程提供了创新平台。

　　

论文解读

背景与挑战
在应对气候变化的全球议题下，蓝藻因其独特的光合固碳能力被视为“绿色细胞工厂”的理想候选。然而，以模式生物Synechocystis sp. PCC 6803（集胞藻PCC 6803）为代表的蓝藻面临遗传工具稀缺的瓶颈，尤其缺乏高效、可编程的基因激活技术。传统方法如启动子替换或质粒过表达存在操作复杂、动态范围有限等问题，而CRISPR干扰（CRISPRi）仅能实现基因沉默。如何精准上调内源基因表达以优化代谢通路，成为蓝藻合成生物学领域的核心挑战。

研究设计与技术方法
瑞典乌普萨拉大学的研究团队Barbara Bourgade等人开发了一种基于rhamnose（鼠李糖）诱导的CRISPRa系统，通过将大肠杆菌转录激活因子SoxS R93A突变体与失活的Francisella novicida dCas12a蛋白融合，构建了dCas12a-SoxS工具。该系统通过设计向导RNA（gRNA）靶向启动子区-100至-200 bp区域（最优窗口为-97至-156 bp），招募RNA聚合酶实现基因激活。研究采用荧光报告基因（GFP）验证工具性能，并通过气相色谱（GC）和RT-qPCR分析IB/3M1B产量及靶基因表达。

研究结果

1. CRISPRa系统的开发与表征
通过靶向不同位置的gRNA测试，发现非模板链（NTS）的激活效率更高，双gRNA组合（如-108/-156）可产生协同效应。系统对弱启动子（如J23101）的激活倍数（2.28倍）显著强于强启动子（J23116仅1.21倍），但整体动态范围受限于蓝藻多染色体拷贝特性。

2. 生物燃料合成基因的靶向激活
在携带1-3拷贝kivD^S286T（α-酮异戊酸脱羧酶基因）的工程菌中，CRISPRa虽成功上调kivD转录（最高3.19倍），但IB/3M1B产量仅小幅提升，表明底物供应或翻译后调控成为新瓶颈。

3. 代谢通路关键节点的筛选
上调丙酮酸激酶基因pyk1使IB/3M1B产量最高提升4倍，而三磷酸异构酶（tpi）和苹果酸酶（me）的激活仅早期有效。NADPH再生相关基因petH（铁氧还蛋白-NADP⁺氧化还原酶）的持续激活显著提升产物积累，揭示辅因子平衡的重要性。

4. 多基因协同调控的突破
同时激活pyk1/pyk2或me/acnSP（乌头酸酶调控蛋白）使3M1B产量提升6倍，但slr6040（渗透压响应调节因子）的抑制与me激活存在拮抗作用，凸显代谢网络的复杂性。

结论与意义
该研究首次在蓝藻中建立了高效、可逆的CRISPRa平台，突破了传统基因激活技术的局限性。通过系统优化gRNA设计策略（如非模板链优先、双靶点协同），实现了对异源和内源基因的精准调控。研究发现pyk1和petH是关键限速节点，而多基因组合调控可产生非线性增产效应，为“设计-构建-测试”的代谢工程循环提供了新范式。论文发表于《Communications Biology》，为光合微生物的高值化合物合成开辟了道路，未来可扩展至基因组规模筛选或复杂遗传回路构建。