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为探究血管发育和造血调控机制，研究人员以斑马鱼为模型开展 klhl4 功能研究。利用 CRISPR/Cas9 构建突变体，发现 klhl4ci50突变胚胎 ISV Sprouting 延迟，相关分子标记表达降低，细胞凋亡增加、增殖减少。揭示 klhl4 在胚胎血管内皮和造血发育中的新作用，具重要科学意义。
在生命的最初蓝图绘制中，血管系统与造血过程如同精密交织的神经网络，承载着胚胎发育的关键脉络。然而，调控这两大进程的分子机制却像被薄雾笼罩的秘境，尽管科学家已揭开部分面纱，诸如 KLHL（Kelch 样）蛋白家族作为泛素化靶蛋白的适配器在细胞命运抉择中扮演着调控者角色，但它们在血管发育领域的具体戏份却一直未被详细解读。斑马鱼因其胚胎透明、发育迅速且与人类基因高度保守等特性，成为破解这一谜题的理想 “活体说明书”。在这样的背景下，探索斑马鱼中 KLHL 家族成员如何在血管与造血发育的舞台上演绎关键角色，成为打开这一科学黑箱的重要钥匙。
为了破译 klhl4（kelch-like family member 4）在胚胎发育中的密码，研究人员以斑马鱼为研究对象展开研究。虽然文中未明确提及具体研究机构，但这群科研工作者凭借严谨的科学思维，试图通过基因编辑等技术手段，揭开 klhl4 在血管生成（vasculogenesis，指血管内皮祖细胞从未分化中胚层分化形成原始血管的过程）和造血过程中的神秘面纱。这项研究成果发表在《Developmental Biology》，为理解脊椎动物胚胎发育的分子机制提供了新的视角。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先利用 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术构建 klhl4 功能缺失的斑马鱼突变体（klhl4ci50 line），通过设计两条单向导 RNA（sgRNA，序列为 AAATGTTCGTTAGCAGTACT 和 GGTAAAGTTTATCCATCAGA），与 NLS-Cas9-NLS 蛋白混合后注射到单细胞阶段胚胎，实现基因敲除；其次采用原位杂交（ISH）和杂交链式反应（HCR）技术，对 klhl4 在 15 - 体节至 48 小时胚胎期（hpf）的表达模式进行时空分析；此外，通过延时成像技术追踪血管内皮和造血祖细胞在突变体中的迁移、凋亡及增殖动态变化。
结果
- klhl4 表达模式解析：通过 ISH 和 HCR 分析发现，在 15 - 体节阶段，klhl4 表达于前侧中胚层（ALPM）和后侧中胚层（PLPM）的两条双侧条纹中，提示其在早期血管内皮和造血祖细胞中活跃表达。随着发育推进至 24-48 hpf，其表达逐渐局限于血管内皮细胞，如背主动脉（DA）、后主静脉（PCV）和体节间血管（ISV），表明 klhl4 可能在血管内皮细胞特化和维持阶段发挥特定功能。
- 突变体表型分析：klhl4 突变胚胎虽能存活，但表现出明显的 ISV sprouting 延迟，在 48 hpf 时 ISV 长度较野生型显著缩短。同时，血管内皮特异性标记基因（如 flk1、ve-cadherin）和红细胞特异性标记基因（如 gata1、β- 珠蛋白）的表达水平显著降低，提示 klhl4 缺失导致血管生成和造血分化受损。
- 细胞动态行为观察：延时成像显示，突变体中血管内皮祖细胞和造血祖细胞向中线迁移的速度明显减慢，且细胞凋亡率显著增加（通过 TUNEL 染色检测），同时增殖标志物（如 PCNA）的表达减少，表明 klhl4 可能通过调控细胞迁移、凋亡和增殖来影响血管和造血发育。
- 上游调控因子探究：研究发现，内皮和造血发育的两个关键调控因子 npas4l（缺氧诱导因子相关蛋白）和 etv2/etsrp（Ets 家族转录因子）在突变体中的表达水平显著下调，提示 klhl4 可能通过维持 npas4l 和 etv2 的表达来促进血管和造血发育。然而，过表达 npas4l 或 etv2 未能挽救突变体的 ISV sprouting 缺陷，表明 klhl4 还存在其他非依赖于这两个因子的调控机制。
结论与讨论
本研究首次系统揭示了斑马鱼 klhl4 在胚胎血管生成和造血发育中的关键调控作用。研究发现，klhl4 通过调控血管内皮和造血祖细胞的迁移、凋亡及增殖，同时维持 npas4l 和 etv2 等上游转录因子的表达，多维度促进血管和造血系统的正常发育。尽管 npas4l/etv2 过表达实验提示存在其他调控通路，但 klhl4 作为保守的 KLHL 家族成员，其在斑马鱼中的功能研究为理解脊椎动物（包括人类）胚胎发育中血管与造血系统的互作机制提供了重要线索。由于 Klhl4 蛋白序列在不同脊椎动物中高度保守，该研究结果暗示其在其他物种中可能具有类似功能，为进一步研究人类血管发育异常相关疾病（如先天性心脏病、血管畸形）和造血障碍（如贫血、白血病）的发病机制奠定了基础。未来研究可聚焦于 klhl4 下游具体靶蛋白的鉴定，以及其与其他泛素化通路的互作网络，从而更全面揭示胚胎发育的分子调控网络。
