基于 CRISPR/Cas9 技术的高通量单细胞转录组学增强研究：揭示低丰度转录本的生物学奥秘

为解决单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）因高丰度转录本掩盖低丰度转录本的问题，研究人员开发 single-cell CRISPRclean（scCLEAN）技术。实验表明其可重新分配约 50% reads 至低丰度转录本，在免疫和血管平滑肌细胞中展现潜力，为单细胞分析提供新工具。

　　

论文解读

在生命科学研究领域，单细胞 RNA 测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）如同一位 “侦察兵”，能够深入细胞内部，揭示细胞间的异质性。然而，这位 “侦察兵” 却面临着一个棘手的难题：细胞中高度丰富且普遍存在的转录本往往占据了测序结果的大部分，就像一层厚重的迷雾，将那些表达水平低但具有重要生物学意义的转录本掩盖起来，使得研究人员难以捕捉到细胞真实的基因表达特征，这极大地限制了对细胞功能和疾病机制的深入研究。

为了拨开这层迷雾，来自美国杜兰大学医学院、斯克里普斯研究所等机构的研究人员开展了一项具有创新性的研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为单细胞转录组学研究带来了新的曙光。

研究人员开发了一种名为 single-cell CRISPRclean（scCLEAN）的分子方法。该方法的核心思想是利用 CRISPR/Cas9 系统的可编程性，精准地靶向并去除转录组中不到 1% 的高丰度分子，从而将大约一半的测序 reads 重新分配到低丰度转录本上，提高低丰度转录本的检测灵敏度和分析分辨率。

在技术方法上，研究人员首先通过对多种公开的 scRNAseq 数据集进行计算机模拟分析，筛选出在人类组织中具有高相对丰度和低变异性的基因作为靶点。然后，设计针对这些靶点的单 guide RNA（sgRNA）阵列，并构建 sgRNA 池。实验过程中，将 sgRNA 池与 Cas9 蛋白结合，对单细胞 RNA 测序文库进行处理，实现对高丰度转录本的切割和去除。研究选取了外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）作为研究对象，分别代表异质性细胞群体和同质性细胞群体，验证 scCLEAN 技术的有效性和适用性。

研究结果

scCLEAN 适用于人类多种细胞类型和组织

研究人员基于广泛使用的 10x Genomics Chromium 平台，对 14 种组织类型的 scRNAseq 数据进行分析，确定了包括核糖体基因、线粒体基因和非可变基因（non-variable genes, NVGs）在内的 255 个蛋白编码基因作为 scCLEAN 的靶向基因。这些基因在不同细胞类型和组织中普遍高表达且变异性低，占总比对 reads 的 58% 左右。通过 Tabula Sapiens 单细胞图谱和 GTEx 项目数据进一步分析发现，scCLEAN 在心脏、脑和肾脏等组织中具有较大的应用潜力，而在全血中因可能去除少量标记基因，适用性相对较低。

scCLEAN 无论测序深度如何都能提高灵敏度

在 PBMCs 实验中，与传统的 10x-V3 方法相比，scCLEAN 使非靶向转录组 reads 增加了 2 倍，将高丰度基因贡献的 UMI 比例从 58% 降低到 33%，并显著提高了文库复杂度，使每 1000 个 UMI 对应的独特基因数量增加了 2 倍以上。随机矩阵理论分析表明，scCLEAN 将主成分分析中可用于后续分析的成分数量从 7 个增加到 10 个，表明其能够更好地分离生物信号和噪声，且这种增强的生物学分辨率无法通过更深的测序来实现。

scCLEAN 改善免疫细胞类型鉴定和功能表征

通过标准的数据预处理和聚类分析，scCLEAN 在 PBMCs 中成功鉴定出 5 种额外的细胞类型，如 B intermediate、CD4 Proliferating 等，并提高了细胞类型注释的准确性。利用深度学习无监督聚类方法，在不同的分辨率参数下，scCLEAN 始终能识别出比传统方法更多的细胞簇，进一步验证了其在揭示细胞异质性方面的优势。此外，scCLEAN 处理后的样本能够有效整合到现有的 PBMC 参考图谱中，表明其不影响与参考图谱的兼容性。

scCLEAN 增强 PBMC 中单细胞转录本异构体定量

将 scCLEAN 应用于第三代测序技术 —— 单细胞 MAS-Seq（single-cell MAS-Seq），结果显示，scCLEAN 使非靶向信息转录组的 reads 重新分配增加了约 2.5 倍，显著提高了对未完全剪接匹配（incomplete-splice-match, ISM）、新目录内（novel-in-catalog, NIC）和新目录外（novel-not-in-catalog, NNIC）转录本的定量能力。在基因水平上，scCLEAN 显著增加了每个细胞检测到的 UMI 中位数和基因中位数，并成功鉴定出 cDC1 等细胞类型，展示了其在长读长测序中的应用潜力。

scCLEAN 区分心血管平滑肌细胞的表型状态

在 VSMCs 研究中，scCLEAN 成功将冠状动脉和肺动脉来源的 VSMCs 分为两个不同的谱系，而传统方法无法区分。通过轨迹推断和基因表达分析，发现冠状动脉 VSMCs 具有独特的炎症特征，其 top 过渡标记基因如 IL1A、IL1B 等与炎症反应和 TNF-α 信号通路相关。此外，研究还发现肺动脉 VSMCs 中核因子红细胞 2 相关因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NFE2L2）的激活率显著高于冠状动脉 VSMCs，这可能与抗氧化应激和血管疾病的发生发展有关。

研究结论与讨论

scCLEAN 技术通过选择性去除高丰度转录本，重新分配测序 reads 至低丰度转录本，为单细胞转录组学研究提供了一种全新的思路和方法。它不仅能够提高低丰度转录本的检测灵敏度，揭示传统方法难以发现的细胞异质性和生物学信号，还能应用于不同的测序技术和细胞类型，具有广泛的适用性和灵活性。

在免疫细胞研究中，scCLEAN 有助于更准确地鉴定细胞类型和功能状态，为免疫系统疾病的研究和治疗提供了新的靶点和方向。在心血管疾病领域，scCLEAN 揭示了冠状动脉和肺动脉 VSMCs 在转录水平上的差异，为理解动脉粥样硬化等心血管疾病的发病机制提供了新的视角，特别是冠状动脉特异性炎症信号的发现，为早期干预和治疗提供了潜在的靶点。

然而，研究也指出 scCLEAN 并非适用于所有情况。在应用该技术时，需要根据具体的组织和细胞类型，评估靶向基因的变异性和潜在影响，以确保其有效性和安全性。随着单细胞测序技术的不断发展和多组学研究的深入，scCLEAN 有望与其他技术相结合，进一步推动生命科学和医学研究的进步，为精准医学的发展奠定坚实的基础。