CRISPRi筛选揭示胞嘧啶碱基编辑结果的遗传调控机制及其在基因组编辑中的应用

为解决胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)在基因组编辑中C·G→T·A和C·G→G·C两种主要编辑结果的分子机制不明问题，加州大学圣地亚哥分校Alexis C. Komor团队通过CRISPR干扰(CRISPRi)筛选技术，系统鉴定了调控这两种编辑结果的关键DNA修复因子。研究发现错配修复(MMR)因子MSH2/MSH6促进C·G→T·A编辑，而E3泛素连接酶RFWD3特异性介导C·G→G·C编辑，同时揭示了XPF和LIG3在修复碱基编辑中间体中的作用。该研究为优化碱基编辑工具提供了重要理论基础，发表于《Nature Communications》。

　　

基因组编辑技术近年来取得了突破性进展，其中碱基编辑技术因其能够在不引起DNA双链断裂的情况下实现精准的单碱基修改而备受关注。然而，在胞嘧啶碱基编辑过程中，为什么会产生C·G→T·A和C·G→G·C这两种主要的编辑结果？哪些细胞内的DNA修复因子参与调控这些结果？这些问题一直困扰着研究人员。理解这些分子机制不仅对基础研究具有重要意义，更能为开发更精准、更高效的碱基编辑工具提供理论指导。

加州大学圣地亚哥分校的Sifeng Gu、Zsolt Bodai等研究人员在《Nature Communications》发表了一项重要研究。他们通过将报告基因系统与CRISPR干扰(CRISPRi)筛选相结合，系统鉴定了调控胞嘧啶碱基编辑结果的遗传因素。研究发现错配修复(MMR)系统中的MSH2和MSH6促进C·G→T·A编辑，而E3泛素连接酶RFWD3则特异性介导C·G→G·C编辑。此外，研究还发现3'瓣状核酸内切酶XPF(ERCC4编码)和DNA连接酶LIG3参与将编辑中间体修复回原始C·G碱基对的过程。

研究采用了几个关键技术方法：1)构建了特异性检测C·G→T·A和C·G→G·C编辑结果的荧光报告系统；2)在K562细胞中建立了可诱导表达碱基编辑器rA1-SaBE4(ΔUGI)的CRISPRi筛选平台；3)使用包含2015个DNA修复相关基因的CRISPRi文库进行全基因组筛选；4)通过流式细胞分选和下一代测序(NGS)分析编辑结果；5)在多种细胞系(K562、HeLa、HEK293T)和多个基因组位点验证筛选结果。

在"Development of fluorescent reporters for CBE outcomes"部分，研究人员开发了两种荧光报告系统：一种是将蓝色荧光蛋白(BFP)通过C·G→T·A编辑转化为绿色荧光蛋白(GFP)，另一种是将非荧光GFP变体通过C·G→G·C编辑激活为功能性GFP。通过比较不同胞嘧啶脱氨酶(rA1、eA3A、RrA3F)的编辑效率，最终选择rA1-SaBE4(ΔUGI)用于后续实验。

"Coupling fluorescent reporters for CBE outcomes with CRISPRi screens"部分描述了研究人员建立的筛选系统。他们在CRISPRi表达的K562细胞中整合了可诱导的rA1-SaBE4(ΔUGI)，然后分别用C·G→T·A和C·G→G·C报告系统进行筛选。通过流式细胞分选GFP阳性细胞群体，测序分析sgRNA分布，鉴定出影响编辑结果的关键基因。

"Identification of genes governing the C·G to T·A and C·G to G·C editing outcomes"部分展示了筛选结果。基因本体(GOBP)分析发现，在C·G→T·A筛选中，靶向DNA修复、细胞周期检查点和mRNA稳定性调控基因的sgRNAs富集，而靶向MutSα复合物(MSH2/MSH6)的sgRNAs显著减少。在C·G→G·C筛选中，靶向核苷酸切除修复(NER)相关基因的sgRNAs富集，而靶向UNG和RFWD3的sgRNAs减少。

"Initial validations suggest C·G to T·A editing relies on MSH2 and MSH6 and is hindered by LIG3 and UNG"部分验证了筛选结果。MSH2和MSH6敲除使C·G→T·A编辑效率降低约2.1倍，而LIG3敲除使其增加约2.3倍。UNG敲除使C·G→T·A编辑效率增加2.1倍，同时使C·G→G·C编辑效率降低2.0倍，验证了UNG在促进非T·A编辑结果中的作用。

"Initial validations suggest C·G to G·C editing depends on RFWD3 and UNG and is inhibited by XPF and XPA"部分显示RFWD3敲除使C·G→G·C编辑效率降低1.8倍，而ERCC4和XPA敲除则增加该编辑效率。值得注意的是，RFWD3敲除仅影响C·G→G·C结果，而不影响C·G→A·T结果，表明存在特异性的转位合成(TLS)亚通路。

"Selected genes were further validated at two endogenous sites in K562 cells"部分在HEK3和RNF2两个内源位点验证了关键基因的作用。MSH2敲除使C·G→T·A编辑效率降低1.6倍，而LIG3敲除使其增加1.4倍。RFWD3敲除在RNF2位点使C·G→G·C编辑效率降低1.9倍。通过cDNA回补实验证实了这些表型是由靶基因敲除引起的。

"MutSα and UNG compete to process cytosine base editing intermediates"部分揭示了MutSα和UNG在识别U·G错配中间体时的竞争关系。当UNG被抑制时，MSH2或MSH6敲除显著降低C·G→T·A编辑效率，表明MutSα在UNG缺失时促进C·G→T·A编辑。这种竞争关系在不同细胞系(HeLa和HEK293T)中得到验证。

"RFWD3 promotes the C·G to G·C outcome via RPA-binding and ubiquitination"部分阐明了RFWD3的作用机制。研究发现RFWD3通过其RPA结合和泛素化活性促进C·G→G·C编辑。在HEK293T细胞中，野生型RFWD3回补能恢复C·G→G·C编辑效率，而缺乏RPA结合或泛素化活性的突变体则不能。

"Competition and cooperation of multiple genes shape mixed editing outcomes"部分总结了多种修复因子在调控混合编辑结果中的复杂相互作用。例如，XPF(ERCC4编码)通过切割新合成的DNA链抑制突变形成，而LIG3则通过抑制链置换促进C·G→T·A编辑。这些因子之间的竞争与合作共同决定了最终的编辑结果。

在讨论部分，研究人员提出了一个综合模型来解释胞嘧啶碱基编辑结果的调控机制。MutSα和UNG竞争识别U·G错配中间体：MutSα促进C·G→T·A编辑，而UNG通过产生无碱基位点促进非T·A编辑结果。RFWD3通过其RPA结合和泛素化活性，特异性激活导致C·G→G·C结果的转位合成通路。XPF则通过切割3'瓣状结构抑制突变形成。

这项研究的重要意义在于首次系统鉴定了调控胞嘧啶碱基编辑结果的关键DNA修复因子，阐明了MutSα和RFWD3等蛋白在决定编辑结果中的分子机制。这些发现不仅深化了对碱基编辑机制的理解，还为开发更精准、更可控的碱基编辑工具提供了重要理论基础。例如，通过调控这些修复因子的活性，可能实现对特定编辑结果的定向优化，为基因治疗和功能基因组学研究提供更强大的工具。