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为解决金黄色葡萄球菌（S. aureus）毒力因子异源表达中毒性、翻译后加工及内毒素污染等问题，研究人员开发 pTripleTREP 表达载体。该载体通过 TetR 系统实现严密调控，结合 Twin-Strep-tag 一步纯化，成功表达并纯化 SplA/B，为相关研究提供新工具。
在生命科学和医学领域，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作为一种主要的人类病原菌，其引发的感染不仅带来高昂的医疗成本，还因其复杂的毒力机制给治疗带来挑战。深入研究毒力因子的作用机制，开发针对性的治疗策略，是当前亟待解决的问题。然而，毒力因子的异源表达面临诸多难题，如潜在毒性、特定的翻译后加工需求，以及纯化过程中难以避免的内毒素（如脂多糖 LPS）污染，这些问题可能导致实验结果偏差，阻碍对毒力因子功能的准确解析。此外，传统的异源表达系统（如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）在蛋白成熟和活性维持方面存在缺陷，而金黄色葡萄球菌自身的同源表达工具却因缺乏严密的表达调控和高效纯化系统而应用受限。
为突破这些瓶颈，德国格赖夫斯瓦尔德大学（University Medicine Greifswald）的研究人员开展了一项创新研究。他们开发了一种名为 pTripleTREP 的多功能表达载体，旨在实现金黄色葡萄球菌毒力因子的同源表达与高效纯化。该研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上，为金黄色葡萄球菌的研究提供了关键工具。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过序列和连接酶独立克隆（SLIC）技术构建载体骨架，整合了大肠杆菌 ColE1 复制子和金黄色葡萄球菌 pT181 复制子，确保载体在不同宿主中的稳定性；利用四环素响应元件（TRE）和 TetR 阻遏蛋白组成的诱导表达系统，实现目标基因的严密调控；结合 Twin-Strep-tag 与磁珠（Strep-Tactin?XT coated magnetic beads）的一步纯化技术，实现毒力因子的高效分离。
载体设计与调控机制
pTripleTREP 载体的设计融合了多种功能元件。其骨架包含大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的复制起点（ColE1 和 pT181）、氯霉素抗性基因（cat）作为筛选标记。核心调控元件为四环素诱导系统，包括 TetR 阻遏蛋白和含三个 TRE 的强启动子（PTRE），在无诱导剂时实现目标基因的完全抑制，加入脱水四环素（aTc）后迅速激活表达。此外，载体引入来自枯草芽孢杆菌的转录终止子（ysnF 和 yfhD），有效防止通读漏表达。通过对 ColE1 复制子的突变优化，降低了质粒拷贝数，增强了遗传稳定性，避免了高拷贝导致的毒性基因泄漏问题。
毒力因子的表达与纯化验证
以丝氨酸蛋白酶样蛋白 SplA 和 SplB 为模型靶点，研究人员验证了 pTripleTREP 的性能。Northern blot 和 Western blot 结果显示，在未诱导条件下无 SplA/B 转录和蛋白表达，诱导后 120 分钟蛋白分泌量达到峰值，诱导因子（IF）高达 1200 倍，表明系统具有高动态调控能力。利用 Twin-Strep-tag 结合磁珠的一步纯化流程，获得了纯度超过 99% 的 SplA/B 蛋白，且内毒素含量低于 0.2 EU/mL。质谱分析证实了信号肽的正确切割，酶活实验显示野生型 SplA/B 具有底物特异性催化活性，而突变体无活性，验证了蛋白的正确折叠和功能完整性。
载体的多功能应用拓展
除了蛋白表达与纯化，pTripleTREP 还展现了在基因互补研究中的潜力。通过构建缺失 Twin-Strep-tag 的 pTripleTREP_clpX 载体，成功在 HG001 ΔclpX 突变株中实现 ClpX 蛋白的诱导表达，其表达水平可通过 aTc 浓度精确调控至野生型水平，证明了载体在生理研究和遗传互补中的实用性。
研究结论与意义
pTripleTREP 的开发填补了金黄色葡萄球菌同源表达系统的空白。该载体通过严密的四环素诱导调控和高效的 Twin-Strep-tag 纯化系统，解决了毒力因子表达中的毒性控制、翻译后加工及内毒素污染问题，为研究毒力因子的结构 - 功能关系提供了可靠工具。其模块化设计还为质粒互补、蛋白互作等研究奠定了基础，有望推动金黄色葡萄球菌致病机制的深入解析及抗菌疗法的开发。这项研究不仅丰富了葡萄球菌分子工具箱，更在病原菌研究与新型治疗策略之间架起了桥梁，具有重要的科学价值和临床转化潜力。
