基于 CHA 辅助和 CRISPR/Cas12a 介导的信号转导与放大的 “开启” 型适体 - 免疫侧向流分析法检测小分子靶标

传统小分子靶标 LFAs 多为 “Turn-off” 信号输出，存在灵敏度低和假阳性风险。本研究利用 CRISPR/Cas12a 系统将适体信号转为免疫 LFAs 信号，实现 “Turn-on” 输出。检测腐霉利 LOD 低至 0.015 ng/mL，特异性高、稳定性好，为小分子检测提供新策略。

　　

在食品安全检测的战场上，小分子污染物如农药的快速精准识别一直是研究者们攻坚的堡垒。传统的侧向流分析法（LFAs）虽因操作简便、结果直观成为现场检测的得力干将，但面对小分子靶标时却有难言之隐 —— 其 “关闭”（Turn-off）信号输出模式如同蒙尘的镜子，不仅灵敏度不足，还容易因 “误判” 闹出假阳性的乌龙。想象一下，田间的蔬菜带着微量农药残留走上餐桌，现有的检测技术却可能因信号机制的缺陷让危险漏网，或是误将安全样本打入 “冷宫”，这不仅关乎科研的准确性，更直接牵系着大众的饮食安危。如何打破这一困局，让检测信号能随着靶标浓度升高而 “拨云见日”，成为亟待破解的行业难题。

为了攻克传统 LFAs 在小分子检测中的瓶颈，国内研究团队踏上了探索新检测机制的征程。他们瞄准适体（Aptamer，一种具有高特异性的生物识别分子）与 CRISPR/Cas12a 系统（兼具精准识别与信号放大能力的基因编辑工具）的独特优势，展开了一场跨学科的技术创新。历经反复试验与参数优化，研究团队成功构建了一套基于催化发夹组装反应（CHA，一种无酶等温核酸扩增技术）和 CRISPR/Cas12a 介导的信号转导与放大的 “开启”（Turn-on）型适体 - 免疫 LFAs 检测体系，并将相关成果发表在《Biosensors and Bioelectronics》。

这项研究的核心技术 “组合拳” 包括：首先利用生物素 - 链霉亲和素系统构建样本池，固定适体探针（APTpro）；当样本中存在靶标分子时，适体与靶标结合并释放触发序列，启动 CHA 反应生成大量双链 DNA（dsDNA），实现信号的初级放大；随后，dsDNA 激活 CRISPR/Cas12a 系统，其非特异性单链 DNA（ssDNA）切割活性被唤醒，对荧光标记的报告分子（FAM-ssDNA-Biotin）进行切割；最后，通过抗 6-FAM 免疫 LFAs 对切割释放的 FAM 进行可视化检测，使信号以 “开启” 模式直观呈现。研究过程中，团队对样本池制备、CHA 反应条件、CRISPR/Cas12a 激活参数及 LFAs 组装等 12 项技术参数进行了系统优化。

关键技术方法

研究采用适体探针捕获靶标、CHA 反应实现核酸信号预扩增、CRISPR/Cas12a 系统介导信号转导与二次放大，结合免疫 LFAs 进行可视化检测。通过生物素 - 链霉亲和素系统固定适体，利用 Capture-SELEX 原理实现适体与靶标的特异性结合与信号释放，最终通过检测试纸条 T 线颜色变化实现定性与定量分析。

研究结果

检测性能优化与灵敏度验证

在最优实验条件下，该方法对腐霉利（procymidone）的检测限（LOD）低至 0.015 ng/mL，相较于未采用信号放大策略的传统适体 LFAs，灵敏度提升了 52.67 倍。这意味着即使是极微量的农药残留，也难逃该检测体系的 “法眼”。

特异性与稳定性评估

特异性实验表明，该方法对腐霉利具有高度选择性，与其他结构类似物（如多菌灵、百菌清等）无明显交叉反应，展现出优异的抗干扰能力。在稳定性测试中，不同批次检测结果的相对标准偏差（RSD）均小于 5%，证明了该体系在实际应用中的可靠性。

实际样本检测应用

在蔬菜样本（包括黄瓜、白菜、番茄）的加标回收实验中，腐霉利的回收率介于 94.00%-104.20% 之间，进一步验证了该方法在复杂基质中的实用性，为其从实验室走向田间地头的现场检测奠定了基础。

研究结论与意义

这项研究成功构建了一种 “开启” 型适体 - 免疫 LFAs 检测新平台，通过 CHA 与 CRISPR/Cas12a 的协同作用，巧妙地将传统小分子检测的 “关闭” 信号转换为 “开启” 信号，不仅突破了灵敏度瓶颈，更通过可视化信号输出降低了假阳性风险。其核心创新点在于将适体的高特异性识别、CHA 的高效核酸扩增与 CRISPR 系统的精准信号转导有机融合，形成了一套兼具高灵敏度、高特异性与操作便捷性的检测体系。

从应用价值来看，该方法为食品安全领域中小分子污染物的现场快速检测提供了全新思路，尤其适用于基层检测机构对农产品中农药残留的实时监控。试想，在果蔬批发市场或农田采样现场，检测人员只需通过简单操作即可在短时间内获得直观的检测结果，这将大幅提升食品安全监管的效率与精准度，为守护 “舌尖上的安全” 提供强有力的技术支撑。此外，该研究中建立的信号转换与放大策略也为其他小分子靶标（如兽药残留、生物毒素等）的检测提供了可借鉴的技术模板，有望在生物医药、环境监测等领域激发更多创新应用。