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AML 中 DNMT3A R882H/C 突变检测需平衡灵敏度、时效与操作简易性。本研究开发 Cas12a-based 单管检测体系，结合 ERA 与 SsiI 酶切，实现 0.1% 灵敏度，49 例临床样本验证全检出，为 AML 精准诊疗提供快速灵敏工具。
在生命科学与医学领域，急性髓系白血病（AML）如同潜伏在血液中的 “杀手”，严重威胁人类健康。作为成人最常见的急性白血病，其发病率呈全球上升趋势，即便在医疗水平先进的美国，五年相对生存率也仅 31.9%。AML 的分子机制复杂多样，众多基因变异交织成致病网络，其中 DNA 甲基转移酶 3α（DNMT3A）基因的突变格外引人关注，约 22% 的新发 AML 病例和 36% 的细胞遗传学正常 AML（CN-AML）中都能发现它的身影，尤其是 R882H 和 R882C 变异，像两颗 “毒瘤”，不仅驱动造血干细胞异常分化，还与化疗耐药、预后不良紧密相连。然而，现有的检测手段如桑格测序（Sanger sequencing）灵敏度有限，下一代测序（NGS）虽灵敏却成本高、耗时长，难以在临床快速推广，如何高效捕捉这些低频突变成为诊疗瓶颈。
为突破这一困境，武汉大学中南医院血液科联合周福玲实验室的研究人员展开攻关，相关成果发表在《Biosensors and Bioelectronics》。他们瞄准 CRISPR/Cas12a 系统的高特异性与等温扩增技术的高效性，开发出一种基于 Cas12a 的单管检测体系，致力于实现 DNMT3A R882H/C 突变的快速精准识别。
研究采用的关键技术包括：一是利用工程化改造的 enAsU-R Cas12a 酶，其 mismatch tolerance 特性可精准识别突变位点；二是结合酶促重组酶扩增（ERA）技术，在 37℃恒温下实现靶标 DNA 的快速扩增；三是引入 SsiI 限制性内切酶，选择性切割野生型 DNA，富集突变型模板，三重技术协同提升检测的灵敏度与特异性。研究使用的 49 例 AML 患者基因组 DNA 样本和 6 例外周血样本均来自武汉大学中南医院血液科，为临床验证提供了坚实基础。
临床样本与检测原理
研究通过红细胞裂解液处理外周血样本，经离心获取单个核细胞，采用 TIANamp 基因组 DNA 试剂盒提取基因组 DNA。检测原理如图 1A 所示，ERA 等温扩增与 SsiI 酶切同步进行，SsiI 识别野生型 DNA 特定位点并切割，而突变型 DNA 因序列改变避开酶切，从而在扩增中富集突变型模板，为后续 Cas12a 识别奠定基础。
检测系统的性能优化
通过优化 crRNA 设计与反应条件，该系统展现出卓越性能。在灵敏度测试中，对基因组 DNA 的检测限低至 0.1% 突变等位基因频率，意味着能从千分之一的野生型背景中精准揪出突变 DNA。特异性方面，凭借 crRNA 对靶标序列的单碱基识别能力，有效区分 R882H/C 突变与野生型及其他无关突变，避免假阳性干扰。
临床样本验证
对 49 例 AML 患者样本的检测结果与 NGS 高度吻合，成功识别所有 DNMT3A R882H/C 阳性病例，包括一例突变率仅 0.24% 的样本，充分验证了该方法在临床环境中的可靠性。无论是初诊患者的突变筛查，还是治疗过程中微小残留病灶的监测，该系统均展现出强大的应用潜力。
研究结论表明，这种基于 CRISPR/Cas12a 的单管检测系统，通过 crRNA 优化设计、ERA 等温扩增与限制性酶切介导的野生型抑制三重创新，实现了 DNMT3A R882H/C 突变的高灵敏检测，检测限达 0.1%，且整个流程可在 1 小时内完成，兼具快速、灵敏、经济的优势。临床样本验证显示其与 NGS 结果一致，为 AML 的精准诊断、预后评估和治疗监测提供了新利器。
讨论指出，该系统的特异性核心在于 crRNA 的精准设计，其引导 Cas12a 蛋白靶向结合突变 DNA，激活附带切割活性，通过荧光信号实现检测。与传统方法相比，无需复杂仪器，适用于资源有限的临床实验室，有望推动 AML 分子诊断的普及。尽管目前系统聚焦于 R882H/C 突变，但其设计理念可为其他癌症相关基因突变的检测提供通用模板，助力精准医学在肿瘤领域的广泛应用。这项研究不仅为 AML 诊疗带来新希望，更彰显了 CRISPR 技术在临床检测中的巨大潜力，为基因诊断的革新开辟了新路径。
