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为解决黑曲霉（Aspergillus niger）菌丝 pellet 限制传质效率问题，研究人员通过 CRISPR/Cas9 敲除agsA、agsB、sph3、uge3基因，实现菌丝分散。结合发酵优化，使生物量增 77.52%、蛋白含量增 39.98%，为高效微生物蛋白工厂构建提供新范式。
在全球人口持续增长的背景下，蛋白质需求正面临严峻挑战。传统依赖动植物的蛋白质供应模式，受限于耕地资源、畜牧业健康以及极端气候和疫情等因素，难以满足预计 2050 年达 98 亿人口的需求。开发高效可持续的替代蛋白资源成为当务之急。微生物蛋白因生产效率高、资源消耗低且环境友好，成为研究热点。其中，丝状真菌黑曲霉（Aspergillus niger）作为 FDA 批准的安全菌株，具备发酵周期短、生产可持续等优势，是理想的微生物蛋白生产底盘。然而，其在液体培养中常形成紧密的菌丝颗粒（mycelial pellets），严重阻碍底物和氧气向颗粒中心的传质，降低活性菌丝比例，制约了其工业应用潜力。因此，如何通过改造菌丝形态来提升黑曲霉的蛋白生产能力，成为工业生物技术领域亟待解决的关键问题。
为攻克这一难题，国内研究人员开展了相关研究。研究团队以黑曲霉为研究对象，旨在通过基因编辑技术改造其菌丝形态，进而提高微生物蛋白产量，并探索其背后的代谢调控机制。该研究成果发表在《Bioresource Technology》。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：运用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，对黑曲霉中与菌丝形态形成相关的内源性 α-1,3 - 葡聚糖合成酶基因（agsA、agsB）和半乳糖氨基半乳聚糖（GAG）合成酶基因（sph3、uge3）进行敲除；利用转录组分析（transcriptomic analysis）探究工程菌株的代谢调控和基因表达机制；采用响应面法（RSM）结合 Box-Behnken 设计对发酵培养基进行优化。
菌株筛选与表征
通过形态观察和分子生物学方法（ITS 和 β- 微管蛋白序列测序），确认所使用菌株为黑曲霉。经 CRISPR/Cas9 编辑后的突变菌株，在液体培养基中实现了菌丝颗粒的完全分散，表明基因敲除成功改变了菌丝的宏观形态。
形态工程对生物量和蛋白含量的影响
与野生型菌株（A. niger Li2）相比，工程菌株（A. niger AnΔABSU）的生物量增加了 77.52%，菌丝蛋白含量提高了 39.98%。这一结果表明，通过基因编辑改造菌丝形态，显著提升了黑曲霉的蛋白生产能力。
转录组分析揭示代谢调控机制
转录组分析显示，工程菌株中转运蛋白（ABC 转运蛋白、MFS 转运蛋白、糖转运蛋白）相关基因表达上调，加速了营养物质的摄取和能量代谢；细胞壁完整性通路发生改变，包括 MAPK 信号级联（MAPK signaling cascade）的激活以及对细胞壁应激物的敏感性增加；关键代谢通路中基因表达上调，促进了氨基酸的生物合成。这些代谢变化共同为生物量和蛋白含量的提升提供了分子基础。
发酵优化提升产量
通过响应面法优化发酵培养基，工程菌株的生物量达到 16.67 g/L，蛋白含量达 45.91%，分别比未优化的野生型对照提高了 115.37% 和 67.01%。这表明发酵优化进一步挖掘了工程菌株的生产潜力。
结论与讨论
本研究通过 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑结合发酵优化，成功实现了黑曲霉菌丝形态的工程化改造。敲除agsA、agsB、sph3、uge3基因，通过细胞壁重塑（几丁质减少 12.96%，β- 葡聚糖增加 21.05%）使菌丝完全分散，激活了 MAPK 信号通路，增强了呼吸代谢和氨基酸合成，显著提升了生物量和蛋白含量。发酵优化进一步放大了这一效果。该研究不仅揭示了菌丝形态与代谢调控、生产效率之间的内在联系，还建立了整合形态工程与发酵优化构建高效微生物蛋白细胞工厂的新范式，为解决全球蛋白质短缺问题提供了创新思路和技术支撑，在工业生物技术领域具有重要的应用前景。
