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为解决桔小实蝇（Bactrocera dorsalis）形态学鉴定难的问题，研究人员开发 RPA-CRISPR/Cas12b 可视化检测体系。该体系 43℃下 30-35 分钟内可检测各发育阶段，灵敏度达 3.2 pg μL?1 DNA，为口岸检疫等提供新工具。
桔小实蝇（Bactrocera dorsalis）作为全球多地的检疫性害虫，其幼虫、蛹等阶段与近缘种形态相似性高，传统形态学鉴定耗时长且易出错，尤其在口岸快速检疫场景中难以满足需求。此外，现有分子检测技术如 PCR 依赖大型设备、LAMP 引物设计复杂，亟需一种快速、便携且精准的检测方法。在此背景下，滨州医学院联合北京理工大学、中国海关科学技术研究中心等机构的研究人员，开展了基于重组酶聚合酶扩增（RPA）与 CRISPR/Cas12b 系统的桔小实蝇检测技术研究，相关成果发表于《Scientific Reports》。
研究人员采用的关键技术方法包括：一是利用线粒体 COI 基因设计 RPA 引物与向导 RNA（gRNA），通过 NCBI 数据库比对确保引物特异性；二是优化 RPA-CRISPR/Cas12b 反应体系，结合 DNA 快速提取技术（50-200 秒获取粗提 DNA），实现从样本处理到结果判读的全流程快速化；三是通过梯度稀释基因组 DNA 与交叉反应实验，验证体系的灵敏度与特异性。
研究结果
引物与 gRNA 的筛选
通过 qPCR 荧光定量实验，从 5 条 gRNA 和多对 RPA 引物中筛选出最优组合（gRNA3 与 F1R1）。该组合仅对桔小实蝇 DNA 产生荧光信号，对 10 种近缘种重组质粒及 5 种近缘实蝇样本均无交叉反应，证实其高度特异性。
检测体系的优化2
将 CRISPR 系统中荧光探针（FAM-BHQ1）浓度优化至 1.65 μL，反应体系在 43℃下经 10 分钟 RPA 扩增与 20 分钟 CRISPR 反应后，阳性样本呈现肉眼可见的绿色，阴性对照为粉色。缩短反应时间的同时，保证颜色变化显著。
灵敏度与特异性345验证
梯度稀释实验显示，该体系最低可检测 3.2 pg μL?1 的 DNA 浓度，优于 LAMP 等传统方法。对越南、广东、云南等 7 个地理品系的桔小实蝇各发育阶段（卵、幼虫、蛹、成虫）检测均呈阳性，且单卵样本亦可被有效识别，表明其适用于不同地域与发育阶段的检测需求。
实际应用效能
67利用粗提 DNA 进行检测时，仅需手持反应管即可通过颜色变化判断结果，无需专业设备，满足口岸现场快速检测的需求。实验结果显示，该体系对复杂样本背景下的桔小实蝇识别准确率达 100%。
研究结论与意义
1本研究开发的 RPA-CRISPR/Cas12b 可视化检测体系，首次将 CRISPR/Cas12b 技术应用于昆虫检测领域。该方法兼具快速（30-35 分钟完成检测）、灵敏（3.2 pg μL?1）、特异（无近缘种交叉反应）及操作简便（肉眼判读结果）等优势，突破了传统分子检测对实验室与专业设备的依赖，为口岸检疫、害虫监测及田间快速鉴定提供了新型技术工具。此外，Cas12b 因识别短 PAM 序列（5’-TTN-3’）、脱靶效应低等特性，其与 RPA 的结合模式为其他害虫的分子检测提供了通用化思路，有望推动植物检疫与害虫防控领域的技术革新。研究结果不仅提升了入侵害虫早期预警能力，也为保障农业经济安全、促进国际贸易提供了科学支撑。
