榛树过敏原基因组编辑研究：Cor a基因进化分析与CRISPR-Cas9靶向gRNA设计

本研究针对榛树(Corylus)过敏原致敏性问题，通过多基因组比较分析揭示了Cor a过敏原家族的进化轨迹与变异特征，并首次设计出针对13种Cor a过敏原的高效CRISPR-Cas9 gRNAs，为培育低过敏性榛树品种提供了关键分子工具。研究发现了52个Cor a直系同源基因、56种异构体，并验证了TLP基因家族的扩张现象，成果发表于《BMC Plant Biology》。

　　

榛树作为全球重要的经济作物，其坚果富含营养但也是欧洲坚果过敏的主要诱因。目前已有13种榛树过敏原(Cor a 1-16及TLP)被WHO/IUIS数据库收录，这些蛋白质可引发从皮肤瘙痒到过敏性休克等不同程度的免疫反应。尽管CRISPR-Cas9技术为培育低过敏性作物提供了新思路，但榛树基因组编辑面临两大瓶颈：缺乏高效的再生体系，以及现有生物信息学工具未整合榛树基因组数据导致gRNA设计困难。

为解决这些问题，研究人员对四种榛树物种（欧洲榛C. avellana、美洲榛C. americana、平榛C. heterophylla和毛榛C. mandshurica）进行了全基因组比较分析。通过BLAST和OrthoFinder鉴定了52个Cor a直系同源基因，发现C. americana中Cor a 1存在近期串联复制事件。利用Augustus-PPX模块重新注释了C. avellana中缺失的Cor a 16基因座（命名为Cav04g12115），并将Cor a 10基因模型扩展了1.2kb。系统发育分析揭示了Cor a 1、Cor a 2和Cor a TLP三个基因家族的复杂进化路径，其中TLP基因在C. avellana染色体9上形成112kb的串联重复簇。通过CRISPR-Local工具设计了56个高特异性gRNAs，其切割效率预测值（CFD评分>0.66）和实验验证表明可有效靶向单个或多个Cor a基因，为多基因同步编辑提供了可能。

研究采用的主要技术包括：1）基于BLAST和OrthoFinder的直系同源基因鉴定；2）Augustus-PPX基因结构预测；3）最大似然法构建系统发育树；4）Tajima's D检验和dN/dS分析选择压力；5）CRISPR-Local设计gRNAs并通过PCR验证靶向性。

【Allergenic genes annotation】
在四种榛树基因组中定位到52个Cor a直系同源基因，分布于9条染色体上。通过重新注释发现C. avellana中Cor a 16新基因座Cav04g12115，其与参考序列相似性从<70%提升至>90%。

【Isoallergens identification】
鉴定出56个isoallergens（序列相似性≥67%），其中Cor a 9和Cor a 13存在10种isoforms（相似性>90%）。TLP基因在C. avellana中扩增至15个拷贝，显著多于其他物种。

【Phylogenetic analysis】
Cor a 1在C. heterophylla中呈现独特进化分支，而Cor a 2各物种代表基因均匀分布于不同分支，提示其复制事件早于物种分化。TLP基因的dN/dS值（ω=0.286-0.552）显示纯化选择作用。

【gRNAs design】
设计的gRNAs平均CFD评分为0.746（Cor a 1）至0.629（Cor a 2），其中7个gRNAs可同步靶向15个paralogs。实验验证显示13个gRNAs能特异性扩增目标位点。

该研究首次系统解析了榛树过敏原的进化规律，填补了Cor a 16等基因的注释空白。设计的gRNAs可直接应用于CRISPR编辑，为培育低过敏性榛树品种奠定基础。特别值得注意的是，针对TLP基因簇的多靶点gRNAs有望破解该家族的功能冗余难题。未来研究需结合农杆菌转化等技术实现基因编辑，最终推动榛树过敏原的精准调控。