双光控CRISPRi动态调控果糖代谢高效生物合成D-阿洛酮糖

为解决传统代谢工程中基因敲除和IPTG诱导的时空控制不足问题，研究人员开发了基于YF1/FixJ和iLight-ho1的双光控CRISPRi系统，动态调控大肠杆菌果糖代谢通路。该策略使D-阿洛酮糖产量提升3.26倍（5.924 g/L），转化率达75.8%，创发酵法生产该甜味剂的最高纪录，为光遗传学在食品生物制造中的应用提供新范式。

　　

论文解读

在追求健康饮食的浪潮中，低热量甜味剂D-阿洛酮糖（D-allulose）因其仅提供蔗糖10%的热量却保有70%甜度，成为食品工业的明星分子。这种稀有糖还具有降血糖、抗氧化等生理功能，被美国FDA认证为GRAS（公认安全）物质。然而，传统化学合成法副产物多，酶法转化又面临成本高、稳定性差的瓶颈。虽然微生物发酵被寄予厚望，但大肠杆菌等底盘细胞中复杂的代谢网络常导致目标产物与生长竞争资源——比如D-果糖（D-fructose）会被内源激酶磷酸化分流，而传统基因敲除可能引发细胞致命性损伤，IPTG诱导剂则存在毒性且无法实时开关调控。

针对这些痛点，江南大学等机构的研究团队在《Food Bioscience》发表创新成果。他们巧妙融合两种光遗传学系统（蓝光响应的YF1/FixJ和红光/黑暗响应的iLight-ho1）与CRISPR干扰技术（CRISPRi），构建出能像"代谢红绿灯"般动态调控的双光控系统。通过光信号切换，既可阻断竞争途径基因表达（如fruA、mak等），又能适时启动异源D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPE）通路，实现代谢资源的时空精准分配。

关键技术
研究采用正交性验证的YF1/FixJ（蓝光激活）和iLight-ho1（黑暗激活）双光控开关，结合dCpf1介导的多基因串联CRISPRi阵列，同步抑制4个关键代谢基因。使用HPLC定量D-阿洛酮糖，通过比较不同光照条件下的细胞生长（OD₆₀₀）和产物浓度验证动态调控效果。

研究结果
1. 正交双光控系统的构建
通过启动子强度优化和蛋白质表达动力学测试，证实YF1/FixJ与iLight-ho1系统在E. coli BL21(DE3)中互不干扰。蓝光照射时，YF1自磷酸化激活FixJ，进而启动CRISPRi/dCpf1对fruA等基因的抑制；转入黑暗后，iLight-ho1系统释放抑制因子ho1，驱动DPE表达。

2. 代谢通路的动态重编程
时序光照实验显示，先蓝光（0-12h）后黑暗（12-36h）的策略最优：前期抑制竞争途径使生物量提升1.8倍，后期转换代谢流使D-阿洛酮糖产量达5.924 g/L，较静态调控提高226%。关键中间体D-果糖的胞内残留量降低62%，证实代谢瓶颈被有效解除。

3. 性能对比与机制解析
该系统的生产率（0.197 g/L/h）和体外转化率（75.8%）均超越已报道的发酵法记录。蛋白质组学揭示，双光控使糖酵解关键酶表达下调30-45%，而戊糖磷酸途径活性增强，为DPE提供更多辅因子NADPH。

结论与意义
这项研究开创性地将多波长光遗传学与CRISPRi耦合，突破了传统代谢工程"一刀切"式调控的局限。通过模拟昼夜节律的光照切换，实现了微生物工厂中碳流的智能化分配——既避免基因敲除的不可逆损伤，又克服化学诱导剂的滞后性。5.924 g/L的D-阿洛酮糖产量不仅验证了技术的可行性，更标志着光控代谢工程在食品添加剂合成中的里程碑进展。未来，该策略可拓展至其他高值化合物生产，为绿色生物制造提供可编程的调控工具包。

（注：全文数据均引自原文，未标注的术语如CRISPRi=Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats interference；dCpf1=失活型Cas12a变体）