SDHD H50R 变异功能效应的体内外分析：揭示其作为非致病性多态性的证据

针对 SDHD H50R 变异是否致病存争议，研究人员构建敲入小鼠模型，结合体内外实验（如生存、肿瘤形成、细胞增殖等分析）。发现该变异无胚胎致死性，未显著影响生存、肿瘤发生及细胞功能，证实其为非致病性多态性，为相关肿瘤遗传机制研究提供关键依据。

　　

在生命科学和肿瘤研究领域， Krebs 循环基因与肿瘤发生的关联一直是备受关注的热点。琥珀酸脱氢酶（SDH）作为 Krebs 循环中的关键酶，其编码基因（SDHA、SDHB、SDHC、SDHD）的突变与嗜铬细胞瘤 / 副神经节瘤（PPGLs）、胃肠道间质瘤（GISTs）、透明细胞肾癌（RCC）等多种肿瘤的发生密切相关。然而，对于许多错义突变的功能后果，科学界仍存在诸多争议。例如，此前有研究提出 SDHD 基因的 H50R 错义突变可能与甲状腺癌和乳腺癌的发生相关，但这一结论尚未得到充分验证，且缺乏直接的实验证据支持。在这样的背景下，明确 SDHD H50R 变异的致病性，对于准确解读肿瘤相关基因变异、完善肿瘤遗传风险评估体系具有重要的科学意义和临床价值。

为了探究 SDHD H50R 变异的真实作用，美国俄亥俄州立大学（The Ohio State University）的研究人员开展了一系列深入研究。他们通过构建携带 SDHD^H50R变异的敲入小鼠模型，并结合体内外功能分析，系统评估了该变异对肿瘤发生及细胞功能的影响。研究结果表明，SDHD^H50R变异并未导致小鼠胚胎致死，且在生存分析、肿瘤形成及细胞增殖、代谢等多项功能检测中均未表现出显著异常。综合体内外实验数据，研究人员明确提出 SDHD^H50R等位基因很可能是一种非致病性多态性。这一发现为澄清该变异的临床意义提供了关键证据，有助于避免对相关肿瘤患者的遗传检测结果进行过度解读，同时为后续 SDH 相关肿瘤的发病机制研究奠定了重要基础。该研究成果发表在《Endocrine-Related Cancer》杂志上。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用 CRISPR 介导的重组技术在 C57Bl/6 小鼠囊胚中生成 SDHD^H50R等位基因，通过限制酶消化筛选和 DNA 测序鉴定阳性 Founder 动物；将杂合子小鼠与 Sdhd^flox/flox动物交配，通过 PCR 基因分型和 DNA 测序验证基因型，构建不同基因型小鼠群体；从胚胎中分离制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），并通过 SV40 大 T 抗原转染进行永生化；运用增殖实验、划痕实验、耗氧率（OCR）检测、软琼脂实验、Western blot 等多种细胞功能分析方法，评估变异对细胞行为和信号通路的影响；采用 Kaplan-Meier 生存分析、Fisher 精确检验、卡方分析和 ANOVA 等统计学方法，对体内外实验数据进行分析。实验中使用了来自多个独立窝次的小鼠样本，以减少个体差异对结果的影响。

生成及表征携带 SDHD^H50R等位基因的小鼠

通过 CRISPR 技术成功构建 SDHD^H50R敲入小鼠模型，经基因分型和测序验证，该变异可稳定遗传。将杂合子小鼠交配产生野生型（WT）、杂合子（H50R-Het）和纯合子（H50R-Homo）小鼠，观察至 1 年时， Kaplan-Meier 生存曲线显示三组小鼠生存率无显著差异，且剖检未发现明显肿瘤，组织病理学分析也未观察到甲状腺、肾上腺、肾脏、垂体等器官的特异性病变。

甲状腺肿瘤发生分析

将 SDHD^H50R等位基因导入甲状腺特异性敲除模型（Tpo-cre; Sdhd^flox/flox），超声检测显示 H50R 变异小鼠甲状腺大小与 WT 无差异，而甲状腺特异性敲除小鼠甲状腺明显肿大。组织病理学分析显示，不同基因型小鼠甲状腺癌发生率无显著差异，尽管各组均存在一定程度的滤泡发育异常，但与变异无明显关联。

肾上腺、肾脏和垂体肿瘤发生分析

对 54 只小鼠的肾上腺进行组织病理学检查，未发现嗜铬细胞瘤，仅观察到部分小鼠肾上腺被膜下梭形细胞形成，但与基因型无统计学关联；71 只小鼠的肾脏病理分析显示，部分存在间质或输尿管周围淋巴细胞浸润、淀粉样变性和 / 或纤维化，但分布无显著差异；17 例垂体样本的组织学分析未发现异常。

携带 SDHD^H50R变异的原代细胞分离及分析

从不同基因型小鼠胚胎中分离制备 MEFs，经永生化处理后进行功能分析。增殖实验显示，WT、H50R-Het 和 H50R-Homo 细胞的生长速率无显著差异；软琼脂实验中，所有细胞系均未形成菌落，表明变异未赋予细胞转化能力；划痕实验结果显示，三种基因型细胞的迁移能力无统计学差异；Seahorse 分析仪检测耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），未发现变异对细胞代谢的显著影响。

SDHD^H50R等位基因对其他 SDH 亚基的影响

Western blot 分析显示，H50R 变异未导致 SDHA、SDHB、SDHC、SDHD 亚基的蛋白水平发生变化，表明该变异不会引起 SDH 全酶复合物的稳定性异常。

SDHD^H50R等位基因对 ERK 和 AKT 信号通路的影响

通过 Western blot 检测磷酸化 ERK 和 AKT 的水平，量化分析显示变异组与对照组在信号通路激活程度上无显著差异，提示 SDHD^H50R变异不会通过增强 ERK 或 AKT 信号传导促进肿瘤发生。

综合体内外研究结果，SDHD^H50R变异既不影响小鼠的生存和肿瘤发生，也未对细胞的增殖、迁移、代谢及信号通路产生显著功能影响。与已知的 SDH 亚基功能丧失性突变导致胚胎致死和肿瘤发生的特性不同，该变异并未表现出致病性特征。研究讨论指出，尽管实验存在观察时间有限、组织病理学评估范围局限以及细胞模型差异等潜在不足，但现有数据充分支持 SDHD^H50R为非致病性多态性的结论。这一发现不仅澄清了该变异的临床意义，为肿瘤遗传咨询提供了可靠依据，还为深入研究 SDH 相关肿瘤的分子机制提供了重要参考，有助于推动基于基因变异的肿瘤精准诊断和个性化治疗策略的发展。