利用 CRISPR 技术构建 Hoxa11 和 Hoxd11-3XFLAG 等位基因以研究 Hox11 全基因组结合

Hox 基因下游靶点研究受限，因保守结合域、通用结合位点及缺乏特异性抗体。本研究用 Cas9/CRISPR 构建 Hoxa11FLAG/FLAG和 Hoxd11FLAG/FLAG小鼠模型，验证表达正常，通过 CUT&RUN 和 CUT&Tag 确认结合 Six2 增强子，为解析 HoxPG11 全基因组结合提供工具。

　　

研究背景与意义

在生命发育的神秘蓝图中，Hox 基因（同源框基因，homeobox genes）犹如精准的设计师，通过编码高度保守的转录因子，指导生物体体轴和器官的正确形成。自果蝇中首次发现以来，这类基因便成为发育生物学的核心研究对象。然而，尽管数十年研究揭示了其在胚胎发育、组织再生中的关键作用，一个根本性难题始终未解：这些 “设计师” 究竟如何精准识别并结合基因组中的靶位点，调控下游基因网络？

问题的根源在于 Hox 蛋白的结构特性 —— 其保守的 DNA 结合结构域（同源结构域，homeodomain）仅能识别简单的 AT-rich 核心序列（如 ATTA），缺乏单体特异性。加之商业抗体的匮乏（因蛋白序列高度保守），使得在体内环境中全局解析 Hox 蛋白的结合位点成为挑战。尤其对于 HoxPG11 亚家族（包括 Hoxa11 和 Hoxd11），其在肾脏发育、骨骼模式形成和生殖系统分化中的关键功能已被证实，但其下游靶点几乎完全未知。破解这一谜题，不仅能完善发育调控网络，更为理解相关先天缺陷（如肾脏畸形、肢体发育异常）提供钥匙。

为突破技术瓶颈，美国密歇根大学（University of Michigan）的研究团队开展了一项创新研究。他们利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，构建了携带 3XFLAG 表位标签的 Hoxa11 和 Hoxd11 等位基因小鼠模型，通过表位标签介导的染色质免疫共沉淀技术，首次在体内环境中系统性解析 Hox11 蛋白的全基因组结合图谱。这项成果发表于《Developmental Biology》，为 Hox 基因研究开辟了新路径。

关键技术方法

研究主要采用以下技术：

1. CRISPR/Cas9 基因编辑：在 Hoxa11 和 Hoxd11 基因 5’端编码区插入 3XFLAG 标签，通过 sgRNA 设计实现精准靶向插入，保留基因正常读码框。
2. 多维度模型验证：通过测序、PCR 基因分型、Western blotting 和免疫荧光染色，确认标签插入的准确性和蛋白正常表达。
3. 染色质免疫共沉淀技术：利用 CUT&RUN 和 CUT&Tag 技术，在发育中的小鼠肾脏组织中捕获 Hoxa11-3XFLAG/Hoxd11-3XFLAG 结合的 DNA 片段，结合高通量测序解析全基因组结合位点。

研究结果

1. 小鼠模型的构建与验证

研究人员设计 sgRNA 靶向 Hoxa11 和 Hoxd11 基因翻译起始位点（ATG）附近，通过 CRISPR/Cas9 将 3XFLAG 标签插入 5’端编码区，确保标签与内源蛋白融合表达。测序和 PCR 结果显示，标签插入位点准确，未引入随机突变；Western blotting 证实融合蛋白正常表达，且亚细胞定位与野生型一致（免疫荧光显示定位于细胞核）。进一步通过杂交获得双纯合小鼠（Hoxa11^FLAG/FLAG; Hoxd11^FLAG/FLAG），该小鼠可正常存活、繁殖，无明显发育缺陷（如肾脏或肢体畸形），表明标签插入未干扰基因功能。

2. HoxPG11 蛋白的体内结合验证

为验证模型的功能性，研究团队选择已知的 Six2 增强子（肾脏发育关键调控元件）作为验证靶点。通过 CUT&RUN 和 CUT&Tag 技术，在 E14.5 小鼠胚胎肾脏组织中检测到 Hoxa11-3XFLAG 和 Hoxd11-3XFLAG 蛋白显著富集于 Six2 增强子区域，证实标签融合蛋白保留了野生型蛋白的 DNA 结合能力。这一结果不仅验证了模型的可靠性，也为 HoxPG11 调控肾脏发育的机制提供了直接证据。

3. 全基因组结合图谱的解析准备

尽管文章未完全展示全基因组测序数据，但通过上述验证实验，证实该模型适用于后续 CUT&RUN/CUT&Tag 测序分析。研究生成的基因组数据集已提交至 GEO 数据库（ accession number GSE294463），为领域内研究者提供了重要资源。

研究结论与讨论

本研究通过 CRISPR 介导的表位标签插入技术，成功构建了 Hoxa11-3XFLAG 和 Hoxd11-3XFLAG 小鼠模型。该模型兼具三大优势：① 内源性标签保留蛋白正常表达水平和调控环境；② 3XFLAG 标签提供高特异性结合靶点，规避传统抗体缺陷；③ 双基因纯合小鼠的可育性表明标签插入未破坏基因剂量效应，为双基因协同作用研究奠定基础。

研究的核心突破在于建立了体内解析 HoxPG11 蛋白 - DNA 相互作用的可靠平台。通过验证其与 Six2 增强子的结合，首次在哺乳动物体内直接证明 Hox11 蛋白参与肾脏发育调控网络。这一模型的应用将推动三大方向进展：① 系统性鉴定 HoxPG11 的下游靶点，揭示其在骨骼、泌尿生殖系统发育中的调控网络；② 解析 Hox 蛋白与辅因子（如 TALE 家族蛋白 Pbx/Prep/Meis）的协同结合机制；③ 为 Hox 基因相关疾病（如遗传性肾脏畸形、肢体发育异常）提供致病机制研究工具。

值得注意的是，Hox 基因的保守性使得本研究方法可推广至其他 Hox 亚家族。未来结合单细胞测序和时空特异性敲除技术，有望在细胞类型和发育时序层面精细化解析 Hox 蛋白的基因组结合动态，为理解发育复杂性和疾病发生提供更完整的图谱。

这项工作不仅解决了 Hox 研究中长期存在的技术瓶颈，更以创新模型为支点，撬动了发育生物学和医学领域的新探索。随着全基因组数据的深入分析，Hox 基因调控的神秘面纱将逐步揭开，为发育异常疾病的诊疗带来新启示。