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为探究调控 Ca2?稳态的基因，研究人员利用 CaMPARI2 传感器结合流式细胞术与 CRISPR 筛选（CaMP-Screen），发现 SOCE 和脂质信号通路关键作用，证实 TIM1 是静息状态下 SOCE 的负调控因子，为 T 细胞功能调控机制提供新视角。
论文解读
在细胞的生命活动中，钙离子（Ca2?）如同一位神秘的 “指挥官”，调控着肌肉收缩、神经元活动、免疫细胞功能等诸多关键生理过程。然而，目前科学家们对于编码 Ca2?调控蛋白的许多基因仍知之甚少，传统的低通量单细胞成像方法如同在黑暗中摸索，难以高效地发现这些基因。在这样的背景下，探索一种能够大规模、高通量筛选 Ca2?调控基因的方法，成为了生命科学领域亟待攻克的难题。为了揭开 Ca2?信号调控的神秘面纱，来自相关研究机构的研究人员开展了一项具有突破性的研究，该研究成果发表在《Cell Calcium》上，为 Ca2?信号调控机制的研究带来了新的曙光。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：一是利用 CaMPARI2 传感器，其在结合 Ca2?并经紫外光照射后可不可逆地从绿色荧光转换为红色荧光，通过流式细胞术对这种荧光转换进行分析，从而实现对细胞 Ca2?活动的检测；二是运用 CRISPR pooled 文库进行基因组筛选（CaMP-Screen），以大规模鉴定调控 Ca2?稳态的基因。
研究结果
CaMPARI2 流式细胞术鉴定具有稳态和诱发 Ca2?活动的细胞
研究人员构建了紫外光转换（PC）装置，对表达 CaMPARI2 的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）进行研究。结果发现，在没有激动剂的情况下，约 10% 的细胞呈现光转换阳性，表明培养的成纤维细胞中存在自发的 Ca2?升高现象，且这种内源性 Ca2?活动在其他两种哺乳动物细胞系中也有类似表现。通过与 Fura-2 作为参考进行校准，确定了 CaMPARI2 的 KD 值为 98 nM，证实其可用于通过流式细胞术鉴定细胞的自发或诱发胞质 Ca2?升高。
Orai1 通道和磷脂酶 C 驱动稳态细胞 Ca2?活动
通过应用 Orai1 通道抑制剂 GSK-7975A 和磷脂酶 C（PLC）抑制剂 U-73122，发现两者均降低了非激动剂条件下光转换细胞的比例，表明稳态 Ca2?活动与 PLC 信号和 SOCE 相关。在 Orai 三重敲除 HEK-293 细胞中，SOCE 缺失，而重新表达 Orai1 后部分恢复，且光转换阳性细胞比例也相应变化，进一步证实内源性 Ca2?活动依赖于 IP?介导的 Ca2?释放和 store-operated Orai1 通道。
CaMP-Screen 鉴定调节内源性细胞 Ca2?活动的基因
利用稳定表达全基因组敲除文库的 MEF 细胞进行筛选，经下一代测序分析，鉴定出 468 个潜在的 Ca2?活动增强子基因和 918 个抑制剂基因。基因本体分析显示，增强子基因富集于 “Ca2?离子结合” 和 “G 蛋白调节剂” 标签，抑制剂基因富集于 “离子通道” 和 “磷脂酶” 类别。验证实验证实了 STIM1、Gnas 作为增强子，以及 Snrpn、Havcr1（TIM1）、Pls1 作为抑制剂的作用，其中 TIM1 等基因与多种病理状况相关。
TIM1 抑制增强内源性 Ca2?活动并促进 Jurkat T 细胞的 Th2 样特征
在 Jurkat T 细胞中，沉默 TIM1 导致 TIM1 转录和蛋白水平降低 60%，胞质 Ca2?水平升高，NFAT 核转位增强，IL-2 转录水平增加。TCR 刺激后，TIM1 沉默促进 IL-2 和 IL-4 产生，但不影响 T-bet 转录。GSK-7975A 可部分抑制 Orai1 通道，恢复 TIM1 沉默细胞的基础 Ca2?水平，且 TIM1 过表达在野生型细胞中降低自发活动，在 Orai-TKO 细胞中无此作用，表明 TIM1 通过 Orai 通道发挥作用。
研究结论与讨论
本研究成功开发了 CaMP-Screen 技术，该技术通过流式细胞术实现了对 Ca2?信号基因的快速高效检测。研究不仅揭示了 SOCE 和 cAMP 通路在维持 Ca2?信号中的重要作用，还鉴定出 Snrpn、Havcr1（TIM1）、Pls1 三个新的 Ca2?稳态负调控基因，将基础 Ca2?水平或活动与 Prader-Willi 综合征、肝炎病毒感染和耳聋等严重病理状况联系起来。
对 TIM1 的深入研究表明，其在静息状态下可抑制 SOCE 活动，而在 TCR 激活后作为共刺激分子，释放对 Orai1 的抑制，促进 T 细胞分化，为 TIM1 作为 T 细胞分化调节因子的作用提供了机制解释。尽管研究未发现 STIM2 和 Orai1 在基础 Ca2?活动中的作用，但 CaMP-Screen 技术在离子通道研究和揭示细胞内 Ca2?信号缺陷相关疾病机制方面展现出巨大潜力，有望加速离子通道药物研究，增进对癌症、衰老、神经退行性疾病和糖尿病等疾病的理解。
