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为解决 CRISPR/Cas12a 系统对 DNA 靶点单碱基错配耐受性高、严格依赖 DNA 激活剂的问题，研究人员开发 spacer-split crRNA 激活的 Cas12a 系统（SPCas12a）。其提升单碱基分辨特异性，可直接检测 miRNA，结合等温扩增构建 “AND” 逻辑门平台，对分子诊断意义重大。
在生命科学与医学检测领域，精准识别核酸序列变异如同在复杂迷宫中寻找特定路标，是早期癌症诊断、传染病分型的关键。CRISPR-Cas12a 系统作为新兴分子诊断工具，虽凭借顺式和反式切割双重活性展现潜力，却面临两大棘手难题：对 DNA 靶点单碱基错配的高耐受性，如同 “视力模糊的探测器”，可能误判关键遗传信息；且严格依赖 DNA 激活剂，使得 RNA 检测需额外逆转录步骤，如同为检测流程增设 “复杂关卡”，增加时间、成本与误差风险。如何让 Cas12a 系统兼具 “火眼金睛” 的精准识别能力与 “跨栏高手” 的灵活检测适应性，成为亟待突破的科学瓶颈。
为攻克上述挑战，厦门研究人员开展了相关研究，成果发表在《Analytica Chimica Acta》。他们通过对 crRNA（CRISPR RNA，向导 RNA）结构进行创新性改造，开发出一种含间隔区分裂位点的 spacer-split crRNA 激活 Cas12a 系统（SPCas12a），成功拓展了该系统在分子诊断中的应用边界。
研究主要采用以下关键技术方法：设计合成含间隔区分裂位点的 crRNA 序列，将其分为 Sc RNA（含支架区域）和 Sp RNA（含间隔区片段）；结合等温扩增技术（如指数扩增反应 EXPAR）构建多重检测平台；利用 AlphaFold Server 进行蛋白质结构预测建模，分析 Cas12a 复合物构象变化；以三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系为样本，检测 miRNA-21 和 miRNA-210 生物标志物表达水平。
结果
- SPCas12a 特异性显著提升：通过对比传统全长 crRNA 系统，发现 SPCas12a 对单碱基突变的辨别能力显著增强。实验表明，其可精准区分 ssDNA 和 dsDNA 中的单碱基差异，如同为核酸序列检测配备了 “高精度显微镜”，解决了 Cas12a 系统对 PAM 远端单碱基错配耐受性高的问题。
- 无需逆转录直接检测 RNA：将 crRNA 间隔区远端部分替换为 RNA 靶标，证实 SPCas12a 可绕过 DNA 激活剂依赖和逆转录步骤，直接识别 miRNA 靶点。这一突破如同为 RNA 检测开辟 “绿色通道”，简化了检测流程，缩短了检测时间，降低了操作复杂性与误差风险。
- 结构建模与功能验证：AlphaFold Server 预测显示，SPCas12a 选择的分裂位点使 Cas12a 复合物形成开放结构域，有利于 Cas12a 稳定发挥功能，从分子构象层面揭示了其高特异性与高效性的机制。
- “AND” 逻辑门平台构建：将 SPCas12a 与等温扩增技术结合，构建了可在 40 分钟内处理多重输入的 “AND” 逻辑门检测平台。以 TNBC 亚型细胞系为例，通过同时分析 miRNA-21 和 miRNA-210 生物标志物，成功区分不同细胞系，展现了其在复杂生物样本中实现多靶点精准检测的能力。
结论与讨论
本研究通过 crRNA 结构重编程，成功开发出集高特异性 DNA 突变检测与直接 RNA 传感于一体的 SPCas12a 系统。其核心创新点在于间隔区分裂 crRNA 设计，不仅突破了传统 Cas12a 系统的单碱基错配容忍度与 RNA 检测限制，还通过等温扩增集成实现多重靶点逻辑运算，为分子诊断提供了多功能工具。在精准肿瘤学领域，该系统可通过分析肿瘤相关 miRNA（如 TNBC 的 miRNA-21、miRNA-210）实现癌症亚型精准分型；在传染病检测中，其单碱基分辨能力有助于病毒耐药突变快速识别。此外，split-crRNA 设计原则为优化其他 CRISPR-Cas 系统（如 Cas13、Cas9）提供了普适性策略，有望推动基因编辑与诊断技术向更精准、更灵活的方向发展。研究成果不仅解决了 CRISPR 诊断领域的关键技术瓶颈，还为临床样本的快速、低成本多模态检测开辟了新路径，具有重要的科学意义与转化应用价值。
