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Alport 综合征（AS）是一种遗传性肾病，80%-85% 病例由 COL4A5 基因突变引起，但缺乏相关小鼠模型。本研究针对 c.1517-1G>T 剪接突变，利用 CRISPR/Cas9 构建小鼠模型，发现其出现肾功能恶化、免疫细胞浸润等表型，为研究 XLAS 发病机制提供新工具。
Alport 综合征（AS）作为一种严重的遗传性肾病，因编码 IV 型胶原蛋白的 COL4A3、COL4A4 或 COL4A5 基因突变所致，其中 80%-85% 的病例与 X 连锁的 COL4A5 基因突变相关。患者会出现肾小球基底膜（GBM）结构异常，进而引发蛋白尿、血尿，部分人还伴有耳聋、眼部病变，且多数男性患者最终会发展为终末期肾病（ESRD）。然而，该疾病的发病机制复杂，尤其缺乏与人类病理特征相似的 X 连锁 Alport 综合征（XLAS）小鼠模型，极大地限制了对其发病机制的研究和治疗手段的开发。
为填补这一研究空白，广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心的研究团队开展了相关研究。他们基于临床中发现的一名携带 COL4A5 基因 c.1517-1G>T 剪接突变的 8 岁男性患者，利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，成功构建了首个由剪接突变引发的 XLAS 小鼠模型。该研究成果发表在《Scientific Reports》上，为深入探究 XLAS 的发病机制及治疗策略提供了关键的动物模型支持。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：
- 基因测序与突变验证：通过下一代测序（NGS）确定患者及其家族成员的 COL4A5 基因突变位点，结合小基因（minigene）实验验证该剪接突变会导致 mRNA 异常剪切。
- 动物模型构建：采用 CRISPR/Cas9 系统对 C57BL/6JGpt 小鼠的 Col4a5 基因进行编辑，建立 c.1517-1G>T 突变小鼠模型（KI 小鼠），并通过 PCR 和桑格测序进行基因型鉴定。
- 病理与功能分析：对 KI 小鼠进行肾功能检测（如血尿素氮（BUN）、肌酐（Cre）水平测定）、组织病理染色（HE、PAS、Masson 等）及电镜观察，同时利用免疫组化检测肾间质免疫细胞浸润情况。
研究结果
临床病例与突变分析
该 8 岁男性患者表现为面部水肿、蛋白尿（3+）及血尿，肾活检显示肾小球系膜细胞增生、基底膜增厚与变薄交替出现，免疫荧光显示 GBM 中 COL4A3 和 COL4A5 表达缺失。家族遗传分析表明，COL4A5-c.1517-1G>T 突变呈 X 连锁共分离。小基因实验证实，该突变导致外显子 23 跳过，产生移码突变和提前终止密码子，使 COL4A5 蛋白缩短。
突变小鼠模型的表型特征
- 生长与肾功能：雄性 KI 小鼠自 14 周龄起体重增长缓慢，7 周龄出现血尿，14 周龄尿蛋白 / 肌酐比值显著升高，28 周龄时血清 BUN 和 Cre 水平明显升高，显示肾功能进行性恶化。
- 组织病理变化：7 周龄时肾组织结构基本正常，随年龄增长逐渐出现肾小球硬化、间质纤维化、肾小管萎缩及胶原沉积。28 周龄时，多数肾小球呈现新月体形成和全球硬化，足细胞数量显著减少。
- 超微结构异常：电镜显示 28 周龄 KI 小鼠 GBM 厚度不均、分层撕裂，足突广泛融合消失，与患者的病理特征高度相似。
- 免疫细胞浸润：免疫组化显示 28 周龄 KI 小鼠肾间质中有大量 CD3+T 细胞和 CD68+巨噬细胞浸润，与患者肾活检结果一致，提示免疫炎症在疾病进展中起重要作用。
研究结论与讨论
本研究首次建立了由 COL4A5 剪接突变引发的 XLAS 小鼠模型，该模型不仅重现了人类患者的临床和病理特征，还首次揭示了肾间质免疫细胞浸润在 XLAS 进展中的关键作用。与此前报道的 COL4A5 外显子突变小鼠模型相比，该模型存活时间更长，更贴近人类疾病的渐进性发展过程，为研究 XLAS 的遗传异质性和病理机制提供了理想工具。
研究发现，剪接突变导致 COL4A5 mRNA 异常剪切和蛋白表达减少，进而破坏 GBM 的 α3α4α5 三聚体结构，引发足细胞损伤和免疫微环境紊乱。免疫细胞浸润可能通过促进炎症和纤维化加速肾功能恶化，这为靶向免疫调控治疗 XLAS 提供了新方向。此外，该模型还有助于探索不同突变类型与临床预后的关联，推动基因治疗和个性化医疗的发展。
尽管研究存在未明确 RNA 下调机制、免疫细胞具体作用路径等局限性，但该模型的建立为 Alport 综合征的基础研究和转化医学提供了重要突破，有望加速针对这一遗传性肾病的治疗策略开发。
