缺氧条件下质膜脂蛋白（PLLP）缺失通过激活AKT/ERK通路促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）存活与功能维持

本研究针对缺氧环境下内皮细胞存活机制不明的难题，通过CRISPR/Cas9全基因组筛选发现质膜脂蛋白（PLLP）是调控HUVECs缺氧耐受的关键靶点。研究表明，PLLP缺失通过增强AKT/ERK1/2磷酸化，显著提升细胞增殖、迁移、血管生成及紧密连接功能，并逆转贝伐珠单抗（bevacizumab）的抑制作用，为缺氧相关疾病治疗提供新靶点。

　　

论文解读

研究背景：缺氧环境下的细胞生存困境
缺氧是多种病理过程（如缺血性疾病、肿瘤微环境）的核心特征，会导致内皮细胞功能紊乱甚至死亡。尽管已知缺氧诱导因子（HIF-1^α）和血管内皮生长因子（VEGF）等分子参与调控，但内皮细胞在缺氧中存活的精确机制仍不明确。尤其令人困惑的是，为何部分细胞能在缺氧中“逆势生长”？这一谜题背后可能隐藏着新的治疗靶点。

破题之道：CRISPR筛选锁定关键基因
为系统探索缺氧耐受机制，研究人员利用全基因组CRISPR/Cas9敲除文库（GeCKO v2）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行筛选。这一技术能在单次实验中敲除19,052个基因，通过缺氧压力“优胜劣汰”，最终发现质膜脂蛋白（PLLP）的缺失显著提升细胞存活率。

关键技术方法

1. CRISPR/Cas9筛选：采用GeCKO v2文库转染HUVECs，结合缺氧胁迫筛选存活克隆。
2. 功能验证：通过EdU增殖实验、流式凋亡检测、线粒体压力测试（OCR）及Transwell迁移实验评估表型。
3. 信号通路分析：Western blot检测AKT/ERK^1/2磷酸化水平。
4. 动物模型：脑缺血和后肢缺血小鼠模型验证PLLP表达变化。

研究结果

1. PLLP缺失赋予缺氧耐受性

• 增殖与存活：缺氧24小时后，PLLP敲除（sgPLLP）细胞增殖率比对照组（sgCtrl）高2.1倍，凋亡率降低60%（图2A, E）。
• 代谢激活：线粒体耗氧率（OCR）在sgPLLP细胞中提升1.8倍，表明能量代谢增强（图2G）。

2. 增强迁移与血管生成能力

• 迁移加速：缺氧下sgPLLP细胞伤口愈合速度较对照组快3倍（图3A），Transwell迁移细胞数增加2.5倍（图3E）。
• 血管形成：Matrigel实验中，sgPLLP细胞生成更多分支血管（图4A），且紧密连接蛋白ZO-1膜定位增强（图5C）。

3. 逆转贝伐珠单抗抑制作用

• VEGF上调：sgPLLP细胞分泌的VEGF水平升高1.5倍（图6A）。
• 耐药性：贝伐珠单抗处理下，sgPLLP细胞存活率仍比对照组高70%，AKT/ERK^1/2磷酸化未被完全抑制（图6F）。

4. 信号通路机制
PLLP缺失特异性激活AKT（Ser⁴⁷³）和ERK^1/2（Thr²⁰²/Tyr²⁰⁴）磷酸化，而抑制剂LY294002（AKT抑制剂）和U0126（ERK抑制剂）无法逆转这一效应（图6H, I）。

结论与意义
本研究首次揭示PLLP是缺氧条件下内皮细胞存活的“分子刹车”，其缺失通过AKT/ERK通路促进细胞适应缺氧环境。这一发现不仅解释了肿瘤微环境中内皮细胞的“缺氧生存策略”，还为缺血性疾病提供了潜在治疗靶点。更值得注意的是，PLLP调控的耐药机制为贝伐珠单抗的联合疗法设计提供了新思路——未来或可开发PLLP抑制剂以增强抗血管生成疗效。

论文发表于《Cell Death Discovery》，其创新性在于将CRISPR筛选与缺氧生物学结合，填补了内皮细胞缺氧适应机制的空白。研究团队来自国内机构，实验设计严谨，从体外细胞模型到动物缺血模型的多层次验证增强了结论的可靠性。