高效非病毒靶向基因组整合的三方基因编辑机制研究

为解决传统病毒载体基因插入效率低、安全性差等问题，研究人员开发 enGager 系统（增强型 GATALYST 相关基因组编辑器），通过连接 cssDNA 供体与核定位 Cas9，提升靶向整合效率，在 CAR-T 等应用中表现优异，为基因治疗提供新工具。

　　

在基因治疗领域，精准高效的基因组整合技术一直是研究者追求的目标。传统的同源重组（HR）方法在进行靶向基因敲入（KI）时效率极低，尤其对于大于 4 Kb 的大片段 DNA 插入更是困难重重。病毒载体虽曾是主流选择，但其随机整合风险、免疫原性及生产复杂性限制了临床应用。非病毒载体如环状单链 DNA（cssDNA）虽展现出安全性优势，但其整合效率仍需提升。如何在保证安全性的同时，提高靶向整合效率，尤其是对大基因片段的精准递送，成为亟待解决的关键科学问题。

为突破这一瓶颈，美国东北大学（Department of Bioengineering, Northeastern University）与 Full Circles Therapeutics 等机构的研究人员开展了深入研究。他们开发了一种名为 enGager 的增强型基因组编辑系统，通过将 cssDNA 供体与核定位 Cas9 蛋白融合单链 DNA 结合肽基序，形成 “三方编辑机制”（TESOGENASE），显著提升了靶向基因组整合效率。该研究成果发表在《Nature Communications》上，为非病毒基因治疗提供了新的技术范式。

研究采用了多种关键技术方法：

1. 融合蛋白构建：设计 Cas9 与 RecA、Rad51 等单链 DNA 结合蛋白或其 20 氨基酸短肽（如 FECO、YECO）的融合蛋白，通过质粒或 mRNA 形式递送。

2. 流式细胞术（FACS）：检测报告基因（如 EGFP）的表达效率，量化基因敲入成功率。

3. 脂质纳米颗粒（LNP）递送：实现 mRNA 和 cssDNA 在多种细胞类型中的高效转染，包括 HEK293T、HepG2 及原代 T 细胞。

4. 下一代测序（NGS）：分析脱靶效应及插入片段的序列特异性，验证系统安全性。

研究结果

1. 融合单链 DNA 结合蛋白提升敲入效率

将 Cas9 与 RecA、Rad51 及其突变体（如 Rad51^AE、Rad51^SEAD）融合后，在 K562 细胞中实现了 2-3 倍的敲入效率提升。例如，RecA 融合 Cas9 在 RAB11A 位点插入 2 Kb EGFP 片段的效率达 15.4%，显著高于野生型 Cas9 的 6.8%。即使对于 4 Kb 片段，融合蛋白仍能将效率提升至野生型的 2 倍以上，证明单链 DNA 结合能力对大片段整合的关键作用。

2. 短肽模块实现高效靶向整合

进一步开发的 20 氨基酸短肽模块（如 FECO、WECO）可替代全长蛋白发挥作用。FECO 单拷贝融合 Cas9 即可达到与全长 RecA 相当的效率（1.59 倍提升），且多拷贝串联未进一步增强效果。这表明短肽通过直接结合 cssDNA，形成 “Cas9-sgRNA-cssDNA” 三方复合物，提升局部浓度，而非依赖重组酶活性。

3. 系统普适性与大基因整合能力

enGager 在多种基因组位点（如 RAB11A、B2M）及细胞类型（HEK293、原代 T 细胞、NK 细胞）中均表现出高效性。对于 8 Kb 超大片段，FECO 融合 Cas9 在 RAB11A 位点的整合效率从野生型的 2.97% 提升至 5.17%。在临床相关的 CAR-T 细胞工程中，GS-FECO 融合蛋白实现了 33.4% 的 CAR 基因整合率，较野生型 Cas9 提升超 6 倍，且编辑后 T 细胞对 NALM6 白血病细胞的杀伤效率显著增强。

4. 安全性与递送系统兼容性

脱靶分析显示，enGager 系统在四个潜在脱靶位点的插入率均低于 0.5%，与野生型 Cas9 无显著差异。通过脂质纳米颗粒（LNP）递送时，FECO-mRNA 在 HEK293T 和 HepG2 细胞中持续 7 天维持高效整合，证明其与新型递送技术的兼容性，为体内基因治疗奠定基础。

结论与讨论

enGager 系统通过 “核定位 Cas9 - 单链 DNA 结合模块 - cssDNA 供体” 的三方协同机制，突破了传统非病毒载体在大基因整合中的效率瓶颈。其核心创新在于利用短肽模块替代全长蛋白，在保持高亲和力的同时避免酶活抑制，且兼容多种递送方式。该系统在 CAR-T 细胞治疗中展现出的高效性与安全性，为血液肿瘤等疾病的精准治疗提供了新工具。此外，其对 8 Kb 片段的整合能力突破了病毒载体的包装限制，为需要插入长调控元件或多基因簇的治疗场景开辟了新路径。

尽管存在原代细胞间效率差异等局限性，enGager 的开发标志着非病毒基因编辑技术向临床应用迈出重要一步。未来通过优化单链 DNA 结合基序及同源臂设计，有望进一步提升其在复杂基因组环境中的普适性，推动基因治疗向更安全、高效的方向发展。