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为解析可变剪接（AS）在神经元身份和功能调控中的作用，研究人员以秀丽隐杆线虫为模型，构建神经系统 AS 图谱。发现近 2000 个基因存在差异 AS，鉴定 unc40/DCC 等新 AS 事件，构建调控网络，为神经发育和疾病研究提供新视角。
在生命科学领域，神经元的多样性和功能调控一直是备受关注的核心问题。可变剪接（Alternative Splicing, AS）作为转录组多样化的关键机制，在神经元身份决定和功能调节中扮演重要角色。然而，神经系统中 AS 的全局模式、调控机制及其与神经元类型的关系尚未完全明晰。尤其在单细胞分辨率下，不同神经元类型的 AS 差异及其功能影响仍需深入探索。为填补这些研究空白，来自耶鲁大学医学院、范德堡大学等机构的研究人员聚焦秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）神经系统，开展了系统性的 AS 研究，相关成果发表在《Nature Communications》。
研究人员利用荧光激活细胞分选技术（Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS）从 L4 雌雄同体线虫中分离出 55 种单个神经元类型，结合优化的核糖体耗竭 RNA 测序（RNA-Seq）技术，生成了高分辨率的 AS 数据集。通过整合原始数据可视化、局部定量和转录本水平定量三种分析方法，全面解析 AS 模式。
可视化与定量分析揭示 AS 多样性
通过基因组浏览器 JBrowse2 可视化分析，研究人员在 ric-4 基因中发现其可变第一外显子在 NSM 和 PVM 神经元中呈现差异使用，其中 NSM 优先表达远端外显子（ric-4a），而 PVM 更倾向使用近端外显子（ric-4b），这一结果通过 MAJIQ 软件的局部剪接变异（Local Splicing Variation, LSV）分析得到进一步验证。转录本水平定量工具 StringTie 的数据显示，ric-4a 和 ric-4b 在不同神经元中的表达比例与功能差异密切相关，表明 AS 在神经元特异性功能调控中的重要性。
新 AS 事件的发现与验证
研究发现，轴突导向受体基因 unc-40/DCC 存在两个新外显子（exon 8.5 和 exon 14.5），其中 exon 14.5 在 AVM 神经元中特异性插入，而在其他神经元如 AVL、AWA 中则被跳过。RT-PCR 验证了这些新转录本在整体动物中的存在，且在近缘物种中发现保守的同源外显子，提示其功能重要性。类似地，Slit 受体基因 sax-3/ROBO 鉴定出新型可变第一外显子 5.5 和 exon 9 的可变剪接位点，前者产生缺乏部分免疫球蛋白结构域的短异构体 SAX-3S，后者影响胞内结构域氨基酸序列，两者在不同神经元类型中差异表达，且在进化上高度保守。
全局 AS 模式与功能富集
通过 MAJIQ 分析，研究人员在 1940 个基因中检测到差异可变剪接（Differential Alternative Splicing, DAS），基因本体论（Gene Ontology）分析显示这些基因显著富集于神经元功能相关通路，如离子通道和神经递质传递。进一步分析发现，钾通道和电压门控钙通道基因中 DAS 发生率较高，而核糖体亚基和神经肽编码基因的 AS 模式相对保守，提示 DAS 在神经元兴奋性精细调控中的关键作用。通过对 55 种神经元的成对比较，发现具有相似功能的神经元如纤毛感觉神经元群（ASK、ADF 等）呈现相似的 AS 谱，表明 AS 模式与神经元功能特化的关联性。
序列特征与微外显子的作用
对 AS 事件的序列特征分析表明，差异可变剪接的可变第一外显子通常具有较长的外显子长度和较低的远端内含子保守性，可能与转录起始位点的调控相关。而 cassette exons 中，微外显子（≤27 bp）的 DAS 发生率显著高于较长外显子（75% vs 59%），且在神经元对中的差异剪接比例更高，进一步支持微外显子在神经系统中的重要性。此外，框架移位（Potentially Frame-Shifting, PFS）事件在可变剪接位点中略有减少，但在基因两端富集，提示其对蛋白质 N - 或 C - 末端的调控作用。
剪接调控网络的构建
基于 cassette exons 的外显子剪接包含率（ePSI）和 239 个推定剪接因子（Splice Factor, SF）的表达数据，研究人员构建了剪接调控网络。通过五折交叉验证和多种算法比较，最终选择 glasso 算法构建的网络，其稀疏性达 97%，可解释 80% 的 ePSI 变异。网络中，已知剪接因子如 mbl-1、unc-75 等位于核心节点，同时鉴定出 etr-1、sma-9 等新型调控因子。针对特定基因如 C07A12.7 和 daf-2 的子网络分析，成功捕获已知调控关系并预测新的互作因子，为 AS 调控机制的深入研究提供了丰富假说。
研究结论与意义
该研究首次在单细胞类型分辨率下构建了秀丽隐杆线虫神经系统的 AS 图谱，鉴定出大量新 AS 事件，揭示了 DAS 在神经元功能特化中的广泛作用。通过整合多维度数据，构建了首个线虫神经 AS 调控网络，为解析 AS 的转录后调控机制提供了关键资源。研究结果不仅深化了对神经元多样性分子基础的理解，也为神经系统疾病（如自闭症、神经退行性疾病）中 AS 异常的研究提供了重要模型和理论依据。未来，结合单细胞长读长测序技术，有望进一步揭示 AS 在神经元异质性和动态发育中的复杂调控网络。
