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胶质母细胞瘤（GBM）预后差，其干细胞（GSCs）是关键。研究聚焦去泛素化酶 USP18，发现其在 GBM 中高表达，通过结合 SOX9 并去除 K48 泛素链稳定后者，且受 YY1 转录调控。揭示 YY1/USP18/SOX9 轴，为 GBM 治疗提供新靶点。
胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）作为中枢神经系统最常见且恶性程度最高的原发性肿瘤，尽管当前采用手术联合放化疗的标准治疗方案，但患者中位生存期仅约 14 个月，预后极差。这主要归咎于 GBM 中存在具有自我更新和多向分化能力的胶质母细胞瘤干细胞（glioblastoma stem cells, GSCs），其不仅推动肿瘤的增殖、侵袭、耐药和复发，还导致肿瘤异质性显著，使得彻底清除肿瘤细胞成为临床难题。因此，深入探究调控 GSCs 干性维持和肿瘤恶性进展的分子机制，寻找有效的诊断生物标志物和治疗靶点，成为 GBM 研究领域的迫切需求。
在这样的背景下，南京医科大学第一附属医院等机构的研究人员开展了相关研究，旨在揭示去泛素化酶（deubiquitinase, DUB）家族成员在 GBM 中的作用机制。该研究成果发表在《Cell Death Discovery》上，通过多维度实验揭示了 USP18 在 GBM 中的关键作用及调控网络，为 GBM 的治疗提供了新的思路和潜在靶点。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，利用生物信息学分析（如 Synapse 数据库单细胞数据分析、TCGA 和 CGGA 等公共数据库挖掘）筛选出与 GSCs 相关的关键基因 USP18；其次，通过临床样本（90 例胶质瘤组织）的免疫组织化学（IHC）、蛋白质免疫印迹（Western blot）等实验验证 USP18 的表达与患者预后的相关性；再者，构建 USP18 敲低和过表达的细胞模型（U87、LN229 等胶质瘤细胞系及 GSC23、T3264 等 GSC 模型），结合神经球形成实验、Transwell 迁移侵袭实验、EdU 增殖实验等评估其对细胞干性和恶性表型的影响；此外，通过免疫共沉淀（Co-IP）、质谱分析、泛素化实验等探究 USP18 与 SOX9 的相互作用及调控机制；最后，利用小鼠原位异种移植模型验证 USP18/SOX9 轴在体内对肿瘤生长的影响。
USP18 在胶质瘤细胞及 GSCs 中高表达并与不良预后相关
通过分析 Synapse 数据库的胶质瘤单细胞数据，发现 USP18 在高表达 GSC 标记基因的簇 2 和簇 3 中富集。结合 TCGA-GBM 数据集的加权基因共表达网络分析（WGCNA），确定 USP18 所在的 MEblack 模块与 GSCs 比例高度相关。多个公共数据集（如 GSE124145、GSE4290）显示，USP18 在胶质瘤组织及 GSCs 中的表达显著高于正常脑组织及非干细胞，且其表达水平与胶质瘤 WHO 分级呈正相关，在 IDH 野生型及无 1p/19q 共缺失的胶质瘤中表达更高。临床样本的 Western blot 和 IHC 结果进一步验证了 USP18 的高表达，且 Kaplan-Meier 生存分析表明 USP18 高表达患者生存期更短，提示其作为预后标志物的潜力。
USP18 沉默抑制胶质瘤细胞恶性表型及干性
在 U87 和 LN229 细胞中敲低 USP18 后，细胞活力、克隆形成能力、EdU 阳性率显著降低，迁移和侵袭能力减弱。在 GSC 模型中，USP18 敲低导致神经球形成能力下降，肿瘤球形成频率降低，同时干细胞标志物 CD133、Nestin、SOX2、NANOG 的蛋白水平下调，表明 USP18 对维持 GSCs 干性至关重要。
USP18 过表达通过 DUB 酶活性促进胶质瘤细胞恶性表型及干性
在 USP18 低表达的 U251 和 A172 细胞中过表达野生型 USP18（WT-USP18），显著增强细胞增殖、迁移和侵袭能力，而催化失活突变体 USP18-C64S 则无此作用。在 GSCs 中，WT-USP18 过表达增加神经球形成能力，且干细胞标志物表达上调，进一步证实 USP18 的功能依赖于其去泛素化酶活性。
USP18 直接结合 SOX9 并增强其稳定性
通过 BioGRID 数据库预测并验证 USP18 与 SOX9 的相互作用，免疫共沉淀和免疫荧光实验证实两者在细胞内直接结合并共定位。USP18 敲低加速 SOX9 蛋白降解，而过表达 WT-USP18 延长其半衰期，且蛋白酶体抑制剂 MG132 可逆转 USP18 敲低导致的 SOX9 减少，表明 USP18 通过泛素 - 蛋白酶体途径稳定 SOX9。进一步研究发现，USP18 特异性去除 SOX9 的 K48-linked 泛素链，而非 K63-linked 链，且 SOX9 的 K205 位点是 USP18 介导去泛素化的关键位点。
USP18 通过调控 SOX9 影响胶质瘤细胞功能
rescue 实验表明，在 USP18 敲低的 U87 细胞中过表达 SOX9，可逆转细胞增殖、迁移和侵袭的抑制，恢复神经球形成能力及干细胞标志物表达；而在 USP18 过表达的 U251 细胞中敲低 SOX9，则抵消 USP18 诱导的恶性表型增强，证实 SOX9 是 USP18 发挥功能的关键下游靶点。
USP18/SOX9 轴在体内促进胶质瘤生长
小鼠原位异种移植实验显示，USP18 敲低显著抑制 U87 细胞的颅内肿瘤生长，延长小鼠生存期，而过表达 SOX9 可挽救 USP18 敲低的抑癌效应。在 GSC23 细胞中，WT-USP18 过表达加速肿瘤生长，缩短生存期，而 USP18-C64S 突变体无此作用，敲低 SOX9 同样逆转 USP18 过表达的促癌效应。免疫组化分析显示，USP18/SOX9 轴调控肿瘤组织中干细胞标志物（SOX2、CD133）及增殖标志物 Ki67 的表达，进一步验证其在体内的功能。
YY1 直接结合 USP18 启动子促进其转录
通过 JASPAR、CistromeDB 等多个转录因子预测数据库筛选出 YY1 作为 USP18 的上游调控因子。临床数据显示 YY1 与 USP18 表达呈正相关，敲低 YY1 降低 USP18 的 mRNA 和蛋白水平，过表达则反之。双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实，YY1 通过结合 USP18 启动子的 site3 区域增强其转录活性，突变该位点可消除 YY1 对 USP18 的调控作用。此外，YY1 敲低抑制 GSCs 的肿瘤球形成能力，而过表达 USP18 可部分逆转该效应，表明 YY1 通过调控 USP18 影响 GSCs 干性。
研究结论与意义
本研究首次系统揭示了 USP18 在 GBM 中的促癌机制，即通过去泛素化并稳定 SOX9，维持 GSCs 干性并促进肿瘤恶性进展，而转录因子 YY1 通过激活 USP18 转录形成 YY1/USP18/SOX9 调控轴。该研究不仅为 GBM 的发病机制提供了新见解，还鉴定出 USP18 作为潜在治疗靶点的价值，为开发针对 GBM 的靶向治疗策略（如 USP18 抑制剂或 YY1 拮抗剂）提供了实验依据，有望克服当前治疗瓶颈，改善患者预后。
