tRNA衍生片段作为急性卒中诊断标志物的验证研究：分析定量方法局限性与临床转化挑战

本研究通过RT-qPCR技术验证tRNA衍生片段(tRFs)作为急性卒中(IS/ICH)与卒中模拟病(SM)鉴别诊断标志物的潜力。尽管前期小RNA测序发现ArgTCG53–67和TyrGTA1–19存在表达趋势差异，但技术限制导致其预测价值不足。研究揭示了tRF检测中存在的多序列比对模糊性、片段短小及修饰干扰等核心问题，为开发快速床旁诊断工具提供了方法论改进方向。

　　

急性卒中的诊断挑战与tRF研究价值
在急性卒中诊疗中，每延迟一分钟就有数百万神经元死亡，而缺血性卒中(IS)与脑出血(ICH)需要截然不同的治疗方案。当前CT检查对IS的敏感性有限，且约40%疑似病例最终诊断为卒中模拟病(SM)。非编码小RNA(sncRNA)因其在细胞应激后快速释放的特性成为理想标志物候选，其中转运RNA衍生片段(tRFs)因其疾病特异性表达模式和基因调控功能备受关注。

tRF片段特征与选择策略
研究团队从前期小RNA测序数据中筛选出12个代表性tRFs，包括源自5'端的SerACT^1–15(15nt)和3'端的ArgTCG^53–67等。值得注意的是，不同tRNA同解码器产生的片段长度差异显著，如ValCAC^1–32长达32nt，而ThrCGT^16–30仅15nt。片段选择时发现，部分tRNA如TyrGTA存在多个高丰度片段，提示传统"单一代表片段"假设可能需要修正。

临床验证结果分析
在87例疑似卒中患者(34IS/25ICH/28SM)的EV缺失血浆检测中，仅TyrGTA^1–19在SM与ICH组间呈现临界显著性差异(p=0.0545)。由ThrCGT、TyrGTA和ValCAC组成的"通用tRF模型"区分SM的AUC为0.577，但未达临床实用标准。LASSO回归显示组合模型未能提升预测效能，最佳单标志物TyrGTA^1–19的AUC仅0.574。

技术瓶颈的深度解析
研究揭示了三大技术障碍：1) tRNA基因多拷贝导致的序列比对模糊性，使得30%的tRF读数可能被错误分配；2) 片段末端修饰(如3'-tRFs的2',3'-环磷酸)干扰RNA连接酶效率，导致测序偏差；3) RT-qPCR中短片段(如<17nt)引物设计困难，LeuTAA^8–24检测时出现异常高扩增效率(2.63倍)。

未来研究方向与临床展望
尽管当前结果阴性，研究指出改进方向：1) 开发免连接的单分子阵列检测技术；2) 建立修饰碱基兼容的定量方法；3) 探索床旁电化学检测系统。特别值得注意的是，卒中后4小时内采集的EV缺失血浆样本中，tRF动态变化规律仍需大规模队列验证。该研究为克服RNA标志物转化医学中的"技术死亡谷"提供了重要范式。

方法学创新点
研究采用分级超速离心(17,500×g→166,400×g)制备EV缺失血浆，确保检测非囊泡RNA。引入UniSp2/4/5三标校正体系，并建立包含效率校正的qPCR数据分析流程。在卒中诊断领域首次系统评估了tRF片段选择策略对标志物性能的影响。