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为探究 p53 肿瘤抑制机制，研究人员以斑马鱼和小鼠为模型，通过 CRISPR 筛选、RNA 测序等技术，发现 p53 在缺乏 p21 时仍可诱导细胞周期阻滞，并鉴定出 ccng1、fbxw7、foxo3b 参与该过程，为揭示 p53 通路机制提供新视角。
癌症是威胁人类健康的重大疾病，p53 作为重要的肿瘤抑制因子，其肿瘤抑制机制却一直未被完全阐明。已知 PUMA/BBC3、NOXA/PMAIP1 和 p21/CDKN1A 参与调控细胞凋亡和周期阻滞，但缺乏这些因子的斑马鱼却未出现癌症，这提示可能存在其他 p53 靶点发挥肿瘤抑制作用。此外，p53 在缺乏 p21 时是否仍能诱导细胞周期阻滞也尚不明确。在此背景下，美国阿拉巴马大学伯明翰分校的研究人员开展了相关研究，旨在深入揭示 p53 介导的肿瘤抑制机制及细胞周期调控网络，该研究成果发表在《iScience》。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先构建了斑马鱼 puma-/-、noxa-/-、p21-/-三重敲除（pnp-/-）模型及 mdm2-/-、puma-/-、noxa-/-、p21-/-四重敲除（mpnp-/-）模型，利用 Kaplan-Meier 分析监测肿瘤发生情况。通过 RNA 测序（RNA-seq）分析不同处理下的基因表达谱，筛选差异表达基因（DEGs）。运用 CRISPR-Cas9 G0 “crispant” 筛选技术，针对候选基因进行功能验证，通过免疫组化染色（如 pH3 染色）检测细胞周期状态，结合跨物种比较分析（斑马鱼和小鼠）鉴定保守的 p53 调控基因。
p53 在缺乏 puma、noxa 和 p21 时仍能有效抑制肿瘤发生
研究人员构建了 pnp-/-斑马鱼模型，观察到这些斑马鱼在 450 天内未出现肿瘤，而 p53-/-斑马鱼全部患癌。将致癌突变 BRAFV600E导入 pnp-/-斑马鱼后，其仍未发生黑色素瘤，而 BRAFV600E与 p53-/-联合则导致肿瘤高发。这表明在缺乏 puma、noxa 和 p21 的背景下，p53 仍能通过其他途径发挥肿瘤抑制作用。
pnp-/-斑马鱼对 p53 依赖性凋亡具有抗性，且 p53 在无 p21 时可诱导部分细胞周期阻滞
通过活性 Caspase-3 染色发现，pnp-/-斑马鱼胚胎在辐射后对 p53 介导的凋亡具有抗性，证实 puma 和 / 或 noxa 是 p53 调控凋亡的关键介质。pH3 染色显示，pnp-/-斑马鱼在辐射后 pH3 阳性细胞数减少，虽不及野生型显著，但表明 p53 在缺乏 p21 时仍能诱导部分细胞周期阻滞，说明存在其他 p53 依赖性机制参与该过程。
转录组分析鉴定 p53 调控的保守基因及关键候选基因
对野生型和 pnp-/-斑马鱼胚胎进行 RNA-seq 分析，结合小鼠数据进行跨物种比较，鉴定出 137 个保守的 p53 上调基因。GO 分析显示这些基因富集于细胞周期调控等生物学过程。进一步聚焦 24 个与细胞周期或增殖相关的候选基因，通过在 mpnp-/-模型中分析其表达动态，发现多个基因在早期即被诱导，提示其可能参与 p53 依赖性细胞周期阻滞。
CRISPR 筛选确定 ccng1、fbxw7 和 foxo3b 参与 p53 依赖性细胞周期阻滞
利用 CRISPR-Cas9 crispant 技术在 mpnp-/-斑马鱼中敲除候选基因，发现靶向 fbxw7、foxo3b 和 ccng1 可增加 pH3 阳性细胞数，部分逆转细胞周期阻滞。在辐射处理的 pnp-/-胚胎中，fbxw7 敲除甚至可完全抵消 p53 介导的细胞周期阻滞，证实这三个基因是 p53 依赖性细胞周期阻滞的重要组分。
研究结论与意义
本研究通过斑马鱼和小鼠模型，结合转录组分析和功能筛选，揭示了 p53 在缺乏经典凋亡和细胞周期阻滞因子时仍能通过其他途径抑制肿瘤，鉴定出 ccng1、fbxw7 和 foxo3b 为 p53 依赖性细胞周期阻滞的新组分。跨物种保守性分析强调了 ortholog-paralog 分析的重要性，为理解 p53 调控网络的复杂性提供了新维度。这些发现不仅拓展了对 p53 肿瘤抑制机制的认识，也为开发靶向 p53 通路的癌症治疗策略提供了潜在新靶点。研究结果表明，p53 的肿瘤抑制功能依赖于一个复杂的、保守的转录网络，而非单一途径，这为后续深入研究 p53 通路的多重作用机制奠定了基础。
