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为解决当前植物 CRISPR 编辑定量技术差异大、结果可比性不足的问题，研究人员系统评估了 AmpSeq、PCR-RFLP、T7E1、Sanger 测序、PCR-CE/IDAA、ddPCR 等 8 种方法。发现不同方法定量结果差异显著，PCR-CE/IDAA 和 ddPCR 准确性较高，为植物基因组编辑研究提供了方法选择指南。
精准检测和量化 CRISPR 基因编辑效率是植物基因组编辑应用开发的关键环节。在分析基于瞬时表达的异质群体以及评估向导 RNA（gRNA）在植物体内的性能时，这一点尤为重要。然而，当前研究采用差异极大的技术来量化基因组编辑结果，严重限制了结果的可比性和可重复性。为解决这一问题，来自澳大利亚昆士兰大学（The University of Queensland）的研究人员开展了一项针对植物基因组编辑定量方法的系统性研究，相关成果发表在《iScience》上。
研究人员以瞬时共表达 CRISPR 组件的本氏烟草（Nicotiana benthamiana）为研究对象，选取了 20 个 sgRNA 靶点，覆盖 6 个内源基因，利用靶向扩增子测序（AmpSeq）、PCR - 限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析、T7 核酸内切酶 1（T7E1）分析、桑格测序（Sanger sequencing，结合 ICE、TIDE、DECODR 三种算法）、PCR - 毛细管电泳 / 插入缺失检测（PCR-CE/IDAA）以及 droplet digital PCR（ddPCR）等 8 种技术，对基因组编辑效率进行了测量和比较，并以 AmpSeq 作为基准，评估了各方法的准确性、灵敏度和成本。
研究结果
基于核酸酶消化和片段分离的方法准确性有限
PCR-RFLP 仅适用于 9 个具有限制性酶切位点的靶点，其结果通过琼脂糖凝胶电泳或自动化电泳分析。线性回归显示，该方法与 AmpSeq 的相关性显著（R2=0.77），但存在系统性高估，尤其在中等和低编辑效率时，平均绝对百分比误差（MAPE）较高。T7E1 无需特定序列要求，但受植物基因组序列变异影响，异源双链形成不稳定，导致低灵敏度。尽管自动化电泳（T7E1-T）提高了检测能力，但在低效率靶点仍存在高估，且突变谱多样性会影响其准确性。
桑格测序受碱基调用软件影响显著
桑格测序结合 ICE、TIDE、DECODR 工具分析时，发现测序设施常用的 PeakTrace（PT）软件处理会降低低频率编辑的检测灵敏度。未经 PT 处理的色谱图虽能提高高频编辑的准确性，但在低频时背景噪音干扰严重。三种工具在编辑效率高于 20% 时表现较好，但在植物中常见的低频场景（<30%）下准确性不足，MAPE 值较大，尤其 ICE 在低于 5% 时无法检测。
PCR-CE/IDAA 是可靠的定量方法
PCR-CE/IDAA 通过荧光标记 PCR 扩增子的毛细管电泳，可区分单碱基插入缺失（InDel）。其与 AmpSeq 的 R2 为 0.8，在中高频编辑时准确性高，低频时虽 MAPE 较高，但能有效检测 InDel 大小分布。该方法成本低、易操作，但需注意引物设计以避免等位基因变异干扰，且在极低频率时可能受 DNA 聚合酶非特异性添加核苷酸的影响。
微滴式数字 PCR（ddPCR）准确性高但技术复杂
ddPCR 基于探针脱落法，通过水 - 油乳滴分割 DNA 分子进行绝对定量。其与 AmpSeq 的 R2 为 0.77，在高、中、低频编辑中均表现良好，MAPE 较低，尤其在低频时仍能保持一定准确性。然而，该技术需要专业设备和探针设计，成本较高，操作复杂，适合对灵敏度要求高的场景，如痕量基因编辑检测。
研究结论与讨论
本研究系统比较了植物基因组编辑定量的多种方法，发现不同技术在准确性、灵敏度、成本和技术复杂度上差异显著。PCR-CE/IDAA 凭借可靠的定量能力和相对简便的操作，成为植物瞬时 CRISPR 表达分析的优选方法，尤其适合多倍体植物的纯合性分析。ddPCR 虽准确灵敏，但受设备和成本限制，适用于特定高要求场景。桑格测序在提供序列信息上有优势，但低频定量能力不足，需谨慎使用。核酸酶 - based 方法因准确性和适用性限制，更适合作为初步筛选工具。
该研究为植物基因组编辑领域的研究者提供了关键方法学指南，有助于根据具体应用需求选择合适的定量技术，推动数据标准化和结果可重复性，对植物基因编辑技术开发、gRNA 性能评估及作物改良具有重要意义。
