CRISPR-Cas12h：一种新型crRNA引导的DNA切口酶

本文系统解析了V-H型CRISPR-Cas12h系统的结构与功能机制，揭示其作为crRNA引导的DNA切口酶（nickase）通过RuvC结构域特异性切割双链DNA（dsDNA）非靶链（NTS）的特性。研究通过冷冻电镜结构阐明其狭窄催化中心的空间限制导致靶链（TS）切割活性受限，并开发出腺嘌呤碱基编辑器（ABE-Cas12h）实现高效A-to-G转换，为精准基因编辑和传染病诊断（如猴痘病毒B6R基因检测）提供了新型工具。

　　

Cas12h的crRNA加工机制
研究发现V-H型CRISPR-Cas系统仅含Cas12h效应蛋白和CRISPR阵列，缺乏Cas1/Cas2适应模块。Cas12h通过其RuvC结构域在金属离子依赖条件下切割前体crRNA，生成5'-磷酸化和2'/3'-羟基末端的成熟crRNA。突变实验证实催化残基D465A（dCas12h）完全丧失加工能力，而锌、锰、镁离子可激活该活性。

DNA切割特性与结构基础
Cas12h表现出独特的dsDNA单链切割活性：

1. 仅切割NTS并在PAM下游17 nt处产生切口，对TS无切割能力；

2. 晶体结构显示其RuvC催化口袋因"盖子模体"（D1007-V1023）与相邻环的紧密接触形成8?狭窄空间，阻碍TS进入；

3. 相比Cas12b的18?开放口袋，Cas12h的REC1和TNB结构域构象差异导致TS与催化中心距离增大。

细菌免疫防御功能
尽管缺乏dsDNA断裂能力，Cas12h通过以下机制提供免疫保护：

1. 靶向λ噬菌体必需基因（A/W）显著抑制噬菌斑形成；

2. 结合入侵DNA后抑制转录：靶向rfp基因启动子区域使荧光信号降低80%，而终止子区域无影响；

3. 靶向质粒复制原点可阻断质粒复制，12 bp crRNA匹配即可引发转录停滞。

分子诊断应用
Cas12h的trans切割活性具有以下特征：

1. 被dsDNA/ssDNA激活后非特异性切割ssDNA，对ssRNA无活性；

2. 14 nt以上互补序列可完全激活，中央区（9-14 nt）错配显著抑制活性；

3. 基于该特性建立的猴痘病毒B6R基因检测灵敏度达2.4拷贝/μL。

基因编辑工具开发
将Cas12h与腺嘌呤脱氨酶融合构建的ABE-Cas12h编辑器：

1. 在E. coli中实现Cm^R基因终止密码子修复（A-to-G），效率最高达47%；

2. 优化显示N端融合、32 aa连接肽和30°C反应温度可获得最佳编辑效果；

3. 结构分析提示其紧凑尺寸（约900 aa）较Cas9更利于递送，为开发新型先导编辑（prime editing）系统奠定基础。

该研究首次阐明V-H型CRISPR系统的分子机制，其天然单链切割特性避免了双链断裂风险，在基因沉默、核酸诊断和精准编辑领域展现出独特优势。结构揭示的构象限制为设计新型Cas12变体提供了关键理论依据。