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针对小麦基因组复杂、再生困难等遗传转化瓶颈，研究人员结合 GRF4-GIF1 嵌合蛋白与 RUBY 系统（含 CYP76AD1、DODA、GT 基因的甜菜红素标记系统），在小麦中提升转化效率，发现 GRF4-GIF1 在大麦中抑制再生，通过敲除 RUBY 验证其可作为非破坏性编辑标记。该研究为作物改良提供新工具。
小麦作为全球重要粮食作物，其遗传改良一直面临巨大挑战。小麦基因组庞大且复杂，存在大量高序列相似性基因和重复元件，加上组织培养再生困难，导致遗传转化效率低下。传统的标记系统如 GFP 在小麦中表达不稳定，难以有效追踪转化过程，而抗生素或除草剂抗性标记又存在环境安全隐患。因此，开发高效、安全且可视化的遗传操作工具，成为突破小麦基因编辑瓶颈的关键。
来自以色列特拉维夫大学（Tel Aviv University）的研究团队，针对小麦和大麦遗传转化与基因组编辑中的技术难题，开展了一系列创新性研究。他们将目光聚焦于 RUBY 系统 —— 一种基于甜菜红素生物合成基因（CYP76AD1、DODA、GT）的可视化标记系统，并结合再生调控基因 GRF4-GIF1 嵌合蛋白，成功提升了作物遗传操作的效率与精准度。相关研究成果发表在《Physiology and Molecular Biology of Plants》，为禾本科作物的基因编辑提供了新范式。
主要技术方法
研究采用了以下关键技术：
- 农杆菌介导转化：用于将 RUBY 质粒和 GRF4-GIF1 嵌合蛋白表达载体导入小麦（如 Fielder、Chinese Spring 等品种）和大麦（Golden Promise 品种）的未成熟胚。
- CRISPR/Cas9 基因编辑：设计 sgRNA 靶向 RUBY 系统中的 CYP76AD1 基因，通过敲除验证编辑效率，并观察表型变化。
- 数字 droplet PCR（ddPCR）：检测转基因植株的外源基因拷贝数，筛选单拷贝纯合株系。
- 胁迫耐受性分析：通过叶锈病（Puccinia triticina）接种和盐胁迫（200 mM NaCl）处理，评估 RUBY 相关性状的功能。
研究结果
1. 启动子筛选与 RUBY 系统优化
通过比较 ZmUbi、CaMV35S、OsActin 等启动子在小麦原生质体和胚中的活性，发现 ZmUbi 和 CaMV35S 能驱动强且稳定的表达，而小麦内源启动子 TaActin 和 TaUbi 活性较低。利用 ICCR2:RUBY 质粒（含 GRF4-GIF1）转化小麦，约 47% 再生植株呈现红色表型，且 RUBY 信号在穗部、根系等组织中稳定表达。但在大麦中，GRF4-GIF1 嵌合蛋白抑制愈伤组织分化，改用不含该元件的 ICCR1:RUBY 质粒后，再生效率提升至 85%，表明物种间再生调控机制存在差异。
2. CRISPR/Cas9 敲除 RUBY 系统的功能验证
在单拷贝纯合 RUBY 小麦株系（RUBY-2）中，通过 CRISPR/Cas9 敲除 CYP76AD1 基因，T1 代植株出现绿色与红色分离。测序显示，编辑事件包括插入和缺失突变，导致甜菜红素合成中断。编辑后的植株不仅失去红色表型，对叶锈病的抗性和盐胁迫耐受性也显著下降，证实甜菜红素与抗逆性直接相关。而编辑过程未影响植株育性，表明 RUBY 系统可作为安全的非破坏性标记。
3. RUBY 系统的优势与应用潜力
与 GFP 相比，RUBY 无需荧光设备即可肉眼检测，且在再生植株中表达稳定。其颜色信号不受组织类型限制，适用于从愈伤到成熟植株的全周期监测。此外，RUBY 系统避免了抗生素标记的环境风险，减少了分子检测的工作量，尤其在多倍体小麦的基因编辑中，可通过单拷贝株系筛选提升编辑效率。
结论与讨论
本研究首次在小麦和大麦中系统验证了 RUBY 系统的应用价值，揭示了 GRF4-GIF1 嵌合蛋白在不同物种中的功能差异，并证明甜菜红素不仅是可视化标记，还直接参与植物抗逆过程。RUBY 系统的非破坏性特性，为基因编辑植株的快速筛选和性状追踪提供了高效工具，尤其适用于小麦等基因组复杂的作物。未来，结合组织特异性启动子或与其他抗逆基因堆叠，RUBY 系统有望进一步拓展在作物改良中的应用，推动精准农业与可持续育种的发展。
研究结果不仅突破了禾本科作物遗传转化的技术瓶颈，也为跨物种基因编辑策略提供了重要参考，展现了可视化标记系统在植物生物技术中的广阔前景。
