CRISPR-Cas9 工程化酵母的生物催化还原胺化研究

针对酵母生产手性胺时反应平衡难倾向产物、内源性胺供体利用不足等问题，研究人员以苄基丙酮转化为 (S)-MPPA 为模型，利用 CRISPR/Cas9 敲除 ALT1 并整合多拷贝 cv-ATA，发现乙醇生长阶段可提升产率至 58%，为手性胺合成提供新策略。

　　

手性胺作为药物、农药及聚合物的核心结构单元，在工业领域具有重要地位。目前化学合成手性胺需高温高压等苛刻条件，而微生物催化虽具选择性高、环境友好等优势，但在酵母中实现高效还原胺化面临挑战 —— 反应平衡难以向胺产物方向移动，且内源性胺供体的利用效率不足。例如，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中天然丙氨酸转氨酶（ALT1）会消耗胺供体丙氨酸，同时葡萄糖代谢产生的丙酮酸可能抑制外源转氨酶活性，导致手性胺产率受限。因此，如何通过代谢工程优化酵母的胞内环境，提升还原胺化效率成为关键科学问题。

为解决上述问题，瑞典隆德大学（Lund University）的研究团队开展了一系列研究。他们以苄基丙酮（BA）转化为 (S)-1 - 甲基 - 3 - 苯基丙胺（(S)-MPPA）为模型反应，利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，对酿酒酵母的丙氨酸 - 丙酮酸代谢节点进行改造，旨在通过敲除非必需基因 ALT1 并整合外源 ω- 转氨酶（cv-ATA）基因，减少内源性竞争，提升手性胺合成能力。研究成果发表于《Scientific Reports》。

研究人员采用的关键技术方法包括：

1. CRISPR/Cas9 基因编辑：开发两步法基因替换策略，首先用纳他霉素抗性基因（NatMX）敲除 ALT1，再通过双 gRNA 引导 Cas9 切割，将 NatMX 替换为 cv-ATA 基因，实现 ALT1 的定点替换与多拷贝整合。
2. 生物反应器培养与代谢分析：在可控条件下进行需氧分批培养，通过高效液相色谱（HPLC）检测代谢物浓度，利用核磁共振（NMR）追踪¹⁵N - 丙氨酸和¹³C - 葡萄糖的代谢流向，解析代谢节点调控机制。
3. 流式细胞术与荧光报告基因：引入绿色荧光蛋白（mEGFP）报告系统，通过 RPL22A 启动子驱动荧光表达，实时监测细胞生长状态与胺合成的相关性。

筛选胺供体与全细胞生物转化

研究首先筛选 20 种蛋白 ogenic 氨基酸作为胺供体，发现丙氨酸在 1 M 浓度下可实现近 50% 的 MPPA 产率，显著优于其他氨基酸。这与 cv-ATA 对丙氨酸的高底物特异性一致。进一步通过多拷贝整合 cv-ATA（6-7 拷贝），构建工程菌株 TMB4375 等，证实基因剂量对酶活性的提升作用。

ALT1 缺失与基因替换的效应

敲除 ALT1 并替换为 cv-ATA 后，工程菌株的 MPPA 产率较野生型提升 2.6 倍（0.58 mol/mol vs. 0.22 mol/mol）。代谢分析表明，ALT1 缺失减少了丙氨酸向丙酮酸的分流，同时降低胞内丙酮酸积累。核磁共振显示，葡萄糖生长阶段丙酮酸浓度较高（胞内约 12-20 mM），抑制 cv-ATA 活性；而乙醇生长阶段（二次生长）丙酮酸被消耗，解除抑制，使胺合成显著增强。

生长状态与代谢调控的关联

通过荧光报告基因观察发现，MPPA 合成仅在乙醇生长阶段（diauxic shift 后）启动，与葡萄糖代谢产生的丙酮酸抑制相关。菌株可分为三类：野生型（ALT1+）不产胺；ALT1 缺失但 cv-ATA 单拷贝菌株因乙醇生长缺陷不产胺；而多拷贝 cv-ATA 菌株（6-7 拷贝）可在乙醇阶段高效产胺，表明充足的酶量与代谢状态转换共同促进反应。

副产物分析与代谢网络解析

除 MPPA 外，研究还检测到副产物乙胺（ethylamine），推测由内源性酶催化生成。同时，苄基丙酮可被酵母内源性氧化还原酶转化为 4 - 苯基 - 2 - 丁醇（OH），但 ALT1 缺失菌株中该副反应减少，可能与胞内 NADH/NAD⁺ redox 平衡改变有关。甘油产量在生长缺陷菌株中显著增加，提示代谢流转向能量平衡调控途径。

结论与意义

本研究通过 CRISPR/Cas9 工程化酵母，成功优化丙氨酸 - 丙酮酸代谢节点，证明乙醇生长阶段的低丙酮酸环境是还原胺化的关键。ALT1 替换为 cv-ATA 不仅减少底物竞争，还通过多拷贝表达提升酶活性，最终使 MPPA 产率达 58%。该策略为手性胺的生物合成提供了可推广的代谢工程模型，同时揭示了代谢状态与酶活性调控的相互作用机制，为酵母在生物催化领域的应用开辟了新方向。研究结果不仅推动了微生物合成手性化学品的发展，也为其他需调控代谢节点的生物制造过程提供了借鉴。