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为探讨黑色素瘤免疫治疗抵抗机制，研究人员以 B16 黑色素瘤模型为对象，利用 CRISPR/Cas9 构建酪氨酸酶敲除细胞，发现酪氨酸酶缺失可增加 T 细胞浸润与活化，逆转冷肿瘤表型，且在 PD-1?/?小鼠中增强抗肿瘤活性，为免疫治疗提供新方向。
黑色素瘤作为恶性程度极高的皮肤癌，其免疫治疗抵抗一直是临床难题。尤其是类似人类 “冷肿瘤” 的 B16 模型，因缺乏 T 细胞浸润、对 PD-1 阻断治疗响应有限，深入探究其免疫逃逸机制迫在眉睫。在此背景下，新乡医学院等机构的研究人员聚焦于酪氨酸酶（Tyr）这一黑色素合成关键酶，试图揭开其在肿瘤微环境（TME）中的免疫调控作用。
研究团队利用 CRISPR/Cas9 技术构建了酪氨酸酶敲除（Tyr?/?）的 B16-F10 黑色素瘤细胞，并通过单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）、流式细胞术等手段，系统分析了肿瘤浸润免疫细胞的变化。该研究发表于《BMC Biology》，为黑色素瘤免疫治疗提供了全新视角。
研究采用的关键技术包括：
- CRISPR/Cas9 基因编辑：构建 Tyr 敲除及敲入（KI）细胞系，验证酪氨酸酶功能；
- 单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）：分析肿瘤浸润 CD45?免疫细胞的转录特征，鉴定细胞亚群；
- 流式细胞术：检测 T 细胞表面 PD-1、CTLA-4 等免疫检查点分子及调节性 T 细胞（Treg，Foxp3?）比例；
- 体内肿瘤移植模型：利用 C57BL/6 野生型（WT）及 PD-1?/?小鼠，观察肿瘤生长及免疫细胞浸润。
研究结果
1. 酪氨酸酶缺失逆转 B16 黑色素瘤的 “冷肿瘤” 表型
通过 CRISPR/Cas9 敲除 Tyr 后，B16-F10 细胞色素合成受阻，肿瘤重量显著减轻。单细胞 RNA 测序显示，Tyr?/?肿瘤中 CD4?和 CD8? T 细胞浸润量较 WT 肿瘤增加 3.8 倍，且效应细胞因子 IFN-γ、TNF-α 及转录因子 Tbx21 表达显著上调，提示 T 细胞活化增强。流式细胞术进一步证实，Tyr?/?肿瘤中 T 细胞占肿瘤浸润免疫细胞的 12.08%，而 WT 肿瘤仅为 3.18%，表明酪氨酸酶缺失可将 “冷肿瘤” 转化为 “热肿瘤”。
2. 酪氨酸酶促进 T 细胞耗竭与 Treg 积累
在 Tyr?/?肿瘤中，CD4?和 CD8? T 细胞表面 PD-1 表达分别提升 2.2 倍和 1.8 倍，CTLA-4?细胞比例也显著增加。同时，Foxp3? Treg 在 CD4? T 细胞中的比例达 29.46%，较 WT 肿瘤高 2.24 倍。机制上，酪氨酸酶缺失导致 Nr4a1（PD-1 上游转录因子）表达上调 1.79 倍，揭示其通过增强免疫检查点分子及 Treg 功能抑制抗肿瘤免疫。
3. 酪氨酸酶缺失协同 PD-1 缺陷增强抗肿瘤免疫
在 PD-1?/?小鼠中，Tyr?/?肿瘤重量较 WT 小鼠降低 40%，肿瘤浸润 T 细胞数量进一步增加，且 Treg 比例减少 50%。q-PCR 显示，PD-1?/?背景下，Tbx21、IFN-γ 等效应分子表达较野生型小鼠高 2-3 倍。体内 PD-1 抗体阻断实验表明，Tyr?/?肿瘤对 PD-1 blockade 响应显著，肿瘤重量减少 60%，而 WT 肿瘤无变化，证实酪氨酸酶缺失可逆转 PD-1 抑制剂抵抗。
结论与讨论
本研究首次揭示酪氨酸酶通过抑制 T 细胞浸润、促进免疫检查点分子表达及 Treg 积累，维持黑色素瘤的 “冷肿瘤” 表型。阻断酪氨酸酶可重塑肿瘤微环境，增强 PD-1 缺陷 T 细胞的抗肿瘤活性，为 PD-1 抑制剂治疗失败的患者提供了新策略。
值得注意的是，酪氨酸酶不仅参与黑色素合成，还通过调控 Nr4a1-PD-1 通路影响 T 细胞功能，其双重作用为开发 “酪氨酸酶抑制剂 + PD-1 blockade” 联合疗法奠定了基础。尽管研究基于小鼠模型，但其发现提示临床可通过检测肿瘤酪氨酸酶表达水平，筛选潜在受益人群，推动黑色素瘤个性化免疫治疗的发展。未来需进一步验证该机制在人类肿瘤中的保守性，并探索酪氨酸酶靶向药物的临床转化潜力。
