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本文聚焦食源性致病细菌检测，综述 PCR 及其衍生技术、等温扩增、DNA 杂交、基因组测序、CRISPR/Cas 等分子诊断技术，对比原理、优劣势，展望技术发展方向，为精准便捷的病原菌检测提供参考。
食源性致病细菌是引发食品安全问题的主要因素之一，快速精准的分子检测技术是防控食源性疾病暴发、保障食品安全的有力手段。本综述系统梳理了用于病原菌检测的快速高效分子诊断技术，涵盖聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）及其衍生技术、等温扩增、DNA 杂交、基因组测序，以及成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，CRISPR）/CRISPR 相关蛋白（CRISPR-associated，Cas）检测技术。
各分子诊断技术原理、优势与局限
聚合酶链式反应（PCR）及其衍生技术
PCR 技术基于 DNA 双链复制原理，通过高温变性、低温退火和适温延伸的循环过程，实现特定 DNA 片段的指数级扩增。其优势在于灵敏度高、特异性强、检测速度快，可在数小时内完成对目标病原菌的定性检测。然而，该技术需要精密的温控设备，对反应体系的纯度要求较高，且仅能提供定性结果，难以实现对病原菌的定量分析。衍生技术如实时荧光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）通过引入荧光标记探针，可在 PCR 扩增过程中实时监测产物的积累，实现对病原菌的定量检测，进一步提高了检测的准确性和灵敏度，但成本相对较高。
等温扩增技术
等温扩增技术摆脱了对温度循环设备的依赖，在恒定温度下即可完成核酸扩增。其原理是利用具有链置换活性的 DNA 聚合酶，在特定引物的引导下，通过引发链置换反应，实现核酸的快速扩增。该技术具有操作简便、反应速度快、无需复杂设备等优点，适合在基层实验室或现场检测中应用。常见的等温扩增技术包括环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）、重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）等。但等温扩增技术的特异性相对较低，容易受到反应体系中杂质的干扰，且产物分析方法相对单一，通常需要通过凝胶电泳或荧光显色等方法进行检测，在一定程度上限制了其应用范围。
DNA 杂交技术
DNA 杂交技术的基本原理是利用互补的 DNA 单链能够在一定条件下结合形成双链的特性，通过标记已知核酸序列的探针，与待检测样品中的目标核酸进行杂交，从而实现对病原菌的检测。该技术具有特异性强、操作相对简单等优点，可用于检测病原菌的特定基因序列。例如，荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）技术通过将荧光标记的探针与细胞内的目标 DNA 杂交，可在显微镜下直接观察病原菌的存在和分布。然而，DNA 杂交技术的灵敏度相对较低，对于低浓度的病原菌检测效果不佳，且需要预先已知目标核酸序列，限制了其对未知病原菌的检测能力。
基因组测序技术
基因组测序技术通过测定病原菌基因组的全部或部分核苷酸序列，与已知数据库中的序列进行比对，从而实现对病原菌的鉴定和分型。随着高通量测序技术的发展，基因组测序的成本不断降低，速度不断提高，可实现对病原菌的快速、全面的分析，不仅能够鉴定病原菌的种类，还能揭示其遗传变异、耐药性基因等信息，为食源性疾病的溯源和防控提供重要依据。但基因组测序技术需要复杂的测序设备和专业的数据分析能力，检测成本较高，且数据分析过程较为繁琐，难以在短时间内获得检测结果，目前主要用于病原菌的溯源和研究层面，在现场快速检测中的应用受到一定限制。
CRISPR/Cas 检测技术
CRISPR/Cas 系统是细菌和古菌特有的一种适应性免疫系统，通过识别和切割外源 DNA 来抵御病毒的入侵。基于该原理开发的 CRISPR/Cas 检测技术，利用 Cas 蛋白的核酸酶活性，在向导 RNA（Guide RNA，gRNA）的引导下，特异性识别并切割目标核酸，通过检测切割产物来实现对病原菌的检测。该技术具有高度的特异性和灵敏度，可检测到单个核苷酸的差异，且操作简便、检测速度快，无需复杂的扩增过程，可在恒温条件下完成检测。此外，CRISPR/Cas 检测技术还具有多重检测能力，可同时检测多种病原菌。然而，该技术目前仍处于研究和开发阶段，在实际应用中还存在一些问题，如 Cas 蛋白的稳定性、向导 RNA 的设计和合成成本等，需要进一步优化和改进。
分子生物学检测技术的未来发展方向
随着生命科学和生物技术的不断发展，分子生物学检测技术在食源性致病细菌检测领域的应用将更加广泛和深入。未来的发展方向主要包括以下几个方面：
- 提高检测的准确性和灵敏度：通过优化反应体系、开发新型标记探针和信号放大技术，进一步提高检测方法的准确性和灵敏度，实现对低浓度病原菌的快速检测。
- 实现多重检测和高通量分析：开发能够同时检测多种病原菌的多重检测技术和高通量检测平台，提高检测效率，缩短检测时间，满足大规模食品安全检测的需求。
- 简化操作流程和便携化：研发更加简便、快捷的检测设备和试剂，降低对专业技术人员和复杂设备的依赖，实现现场快速检测，为食源性疾病的应急处置提供技术支持。
- 与其他技术的融合：将分子检测技术与纳米技术、生物传感器技术、人工智能技术等相结合，开发智能化的检测系统，实现对病原菌的实时监测和预警。
通过对上述分子诊断技术的比较分析和未来发展方向的展望，可为开发更加准确、便捷、灵敏的食源性病原菌检测方法提供有价值的参考，有助于更好地应对食源性疾病带来的挑战，保障公众健康和安全。
