CRISPR 介导内源性标记中多 DNA 双链断裂修复通路的比较分析：揭示精准基因编辑新策略

为解决 CRISPR 介导的精准敲入效率低的问题，研究人员探究非同源末端连接（NHEJ）、微同源介导末端连接（MMEJ）和单链退火（SSA）通路对敲入的影响。发现抑制 MMEJ/SSA 可减少缺失、提升准确性，抑制 SSA 还可减少供体错误整合，为提高精准基因编辑效率提供新策略。

　　

在生命科学研究领域，精准操控基因的能力一直是科学家们追求的目标。CRISPR/Cas 系统作为革命性的基因编辑工具，为解析基因功能和疾病治疗带来了曙光。然而，在利用 CRISPR 介导的内源性标记技术时，精准敲入效率低下始终是制约其广泛应用的瓶颈。这一问题的核心在于 DNA 双链断裂（DSB）修复过程中，非同源末端连接（NHEJ）等非同源定向修复（HDR）通路的干扰，导致大量不精确修复事件的发生，如插入缺失（indels）、供体 DNA 不完全整合等。因此，深入探究不同 DSB 修复通路的相互作用机制，寻找提升精准编辑效率的新策略，成为该领域亟待解决的关键科学问题。

为了攻克这一难题，日本东京大学（The University of Tokyo）等机构的研究人员开展了一项关于 CRISPR 介导内源性标记中多 DSB 修复通路的比较研究。他们通过一系列实验，系统分析了 NHEJ、微同源介导末端连接（MMEJ）和单链退火（SSA）通路在基因敲入过程中的作用，旨在揭示各通路对修复结果的具体影响，并探索通过抑制特定通路提升精准编辑效率的可能性。研究成果发表在《Communications Biology》上，为优化 CRISPR 技术提供了重要的理论和实验依据。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：一是长读长扩增子测序（PacBio）结合计算框架 knock-knock，对敲入等位基因的修复模式进行高通量分析，实现了对不同修复事件的精细分类；二是双荧光蛋白标记系统（mNG 和 mScarlet），通过检测双阳性细胞比例，高灵敏度评估双等位基因敲入效率；三是构建 HDR 报告系统（HDRreporter），利用流式细胞术特异性监测对称和不对称 HDR 事件；四是通过化学抑制剂（如 NHEJi、ART558、D-I03）和基因敲降（siRNA）手段，特异性抑制各修复通路的关键组分（如 POLQ、Rad52）。

研究结果

1. NHEJ 抑制不足以完全消除不精确修复

在 Cpf1 和 Cas9 介导的内源性标记实验中，抑制 NHEJ（使用 Alt-R HDR Enhancer V2）显著提升了敲入效率（约 3 倍），并减少了小缺失（<50nt）的发生。然而，即使在 NHEJ 抑制条件下，完美 HDR 事件的比例仍远低于 100%，不精确整合（如不对称 HDR、不完全整合）仍占近一半。这表明其他非 HDR 通路（MMEJ 和 SSA）在 NHEJ 抑制时可能代偿性发挥作用，导致修复结果的异质性。长读长测序分析显示，MMEJ 抑制（ART558）可减少大缺失（≥50nt）和复杂 indels，而 SSA 抑制（D-I03）对修复模式分布无显著影响，但两者与 NHEJ 抑制联用时，双等位基因敲入效率（通过双荧光标记检测）进一步提升，提示 MMEJ 和 SSA 通路在特定条件下对敲入效率有协同影响。

2. MMEJ 和 SSA 通路对不精确修复的贡献不同

MMEJ 抑制主要通过减少供体非依赖修复中的基因组缺失来提升完美 HDR 频率。序列分析表明，MMEJ 介导的修复依赖于微同源序列（2-20nt）的退火，抑制其关键酶 POLQ 可显著降低切割位点附近的删除频率，尤其是在富含 T 序列的区域。然而，MMEJ 抑制对供体整合的不精确性（如不对称 HDR）无显著影响，说明其主要作用于供体非依赖的修复过程。

与之相反，SSA 抑制不仅减少小基因组缺失，还能显著降低供体错误整合事件，尤其是不对称 HDR。SSA 通路依赖 Rad52 介导的较长同源序列退火，抑制 Rad52 可选择性减少切割位点下游特定区域的缺失，这与 Cpf1 切割产生的单链悬垂结构中微同源序列的分布有关。在荧光分选的阳性细胞中，SSA 抑制导致不对称 HDR 和不完全整合事件显著减少，表明其对供体整合精确性的直接影响。HDR 报告系统进一步验证，SSA 抑制可特异性降低不对称 HDR 的比例，而 MMEJ 抑制无此效果。

3. 修复通路抑制效果的基因组背景依赖性

不同基因位点对 MMEJ 和 SSA 抑制的敏感性存在差异。例如，在 RAB11A 位点（Cas9 介导的平末端切割），SSA 抑制对敲入效率无显著影响，而在 HNRNPA1 和 HNRNPA3 位点（Cpf1 介导的粘性末端切割，存在富含微同源的单链悬垂），SSA 抑制可显著提升双等位基因敲入效率。这表明切割位点的 DNA 末端结构（平末端 vs. 粘性末端）和局部基因组序列（微同源含量）是决定修复通路选择的关键因素。此外，Cas9 和平末端切割更易导致野生型修复，而 Cpf1 的粘性末端切割则倾向于产生更多缺失，进一步突显了核酸酶类型对修复结果的影响。

研究结论与讨论

本研究系统揭示了 CRISPR 介导的基因敲入中，NHEJ、MMEJ 和 SSA 通路的复杂相互作用。尽管 NHEJ 是主要的非 HDR 通路，但其抑制并不能完全消除不精确修复，MMEJ 和 SSA 通路在特定基因组环境下可显著影响修复结果。其中，MMEJ 主要通过微同源介导的删除影响供体非依赖修复，而 SSA 则通过促进不对称 HDR 和不完全整合导致供体错误整合。通过抑制这些通路（尤其是 SSA），可有效减少多种不精确修复模式，提升精准敲入效率。

这些发现具有重要的科学和应用价值：在机制层面，首次明确了 MMEJ 和 SSA 通路在 CRISPR 敲入中的具体作用及相互关系，补充了 DSB 修复通路竞争的理论框架；在技术层面，提出了联合抑制 NHEJ 和 SSA/MMEJ 的策略，为优化 CRISPR 编辑方案提供了新方向，特别是在需要高精准性的基因治疗（如单基因病矫正）和细胞标记应用中具有潜在价值。此外，研究还提示，选择合适的 Cas 核酸酶（如 Cpf1 vs. Cas9）和评估靶点的基因组背景（如微同源分布），对于预测和调控修复结果至关重要。未来，进一步开发通路特异性抑制剂或组合疗法，可能成为突破精准基因编辑效率瓶颈的关键手段。