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鲍曼不动杆菌（A. baumannii）是重要医院感染病原菌，其 CRISPR-Cas 系统与耐药及毒力密切相关但机制不明。本研究构建 cas3 缺失突变株及互补株，发现 cas3 缺失显著降低生物膜形成、毒力及致病性，揭示 cas3 通过调控毒力因子及代谢通路增强毒力，为靶向治疗提供新方向。
鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）作为一种棘手的革兰氏阴性条件致病菌，常常在医院环境中引发肺炎、菌血症等感染，尤其对免疫力低下患者威胁极大。随着多重耐药菌株的不断涌现，世界卫生组织已将碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌列为急需新型抗菌药物的病原菌之一。尽管针对其耐药机制的研究已较为深入，但毒力调控机制仍有诸多未解之谜。CRISPR-Cas 系统作为细菌的适应性免疫系统，除了抵御外源核酸入侵，近年研究发现其与细菌毒力、生物膜形成等生理功能密切相关。然而，I-Fa 型 CRISPR-Cas 系统中的关键蛋白 Cas3 在鲍曼不动杆菌中的具体作用却一直模糊不清。在此背景下，扬州大学医学院等机构的研究人员开展了相关研究，旨在揭示 Cas3 蛋白在鲍曼不动杆菌毒力调控中的角色，该研究成果发表在《Communications Biology》。
为探究 Cas3 的功能，研究团队构建了鲍曼不动杆菌 ATCC19606 菌株的 cas3 基因缺失突变株（19606Δcas3）及互补株（19606Δcas3/pcas3），并综合运用多种技术手段：通过结晶紫染色和激光共聚焦显微镜（CLSM）观察生物膜形成能力；利用 A549 人肺泡上皮细胞模型检测细菌黏附与侵袭能力；借助大蜡螟幼虫和小鼠感染模型评估致病性；采用 RNA 测序（RNA-seq）分析基因表达谱变化，结合实时定量 PCR（qRT-PCR）验证关键基因表达。
结果
1. Cas3 缺失不影响细菌生长但显著抑制生物膜形成
通过监测 OD600值及活菌计数，发现野生型、cas3 缺失株及互补株的生长曲线无显著差异，表明 Cas3 并非细菌生长必需。然而，结晶紫染色显示，cas3 缺失株的生物膜形成能力较野生型显著下降，互补株则恢复该能力。激光共聚焦显微镜进一步观察到，缺失株的生物膜厚度及胞外多糖（EPS）荧光强度明显降低，证实 Cas3 对生物膜结构完整性至关重要。
2. Cas3 缺失导致毒力及致病性减弱
在 A549 细胞感染实验中，cas3 缺失株的黏附率和侵袭率较野生型显著降低。大蜡螟幼虫感染模型显示，野生型感染幼虫在 12 小时内死亡率达 90%，而缺失株感染幼虫 96 小时后存活率仍为 50%。小鼠菌血症模型中，缺失株感染小鼠的各器官细菌载量显著低于野生型及互补株，肺组织病理切片显示其炎症反应明显减轻，血清中促炎细胞因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 水平也显著降低，表明 Cas3 对鲍曼不动杆菌的体内致病能力不可或缺。
3. RNA-seq 揭示 Cas3 调控的分子机制
转录组分析显示，cas3 缺失导致 539 个基因差异表达，其中与生物膜相关的 Csu 菌毛基因（csuA、csuB、csuC、csuE）、外膜蛋白 A（OmpA）及双组分调控系统 BfmSR 的表达显著下调。KEGG 通路分析表明，碳代谢和氧化磷酸化通路受到显著影响，缺失株的胞内 ATP 含量明显降低，提示 Cas3 可能通过调控能量代谢增强毒力。
结论与讨论
本研究首次系统阐明了 I-Fa 型 CRISPR-Cas 系统中 Cas3 蛋白在鲍曼不动杆菌中的非免疫功能：其通过上调生物膜相关基因（如 Csu 菌毛）、毒力因子（如 OmpA）及能量代谢通路（如氧化磷酸化），显著增强细菌的黏附能力、生物膜形成及体内致病性。值得注意的是，鲍曼不动杆菌中不同 CRISPR-Cas 亚型（如 I-Fa 与 I-Fb）对毒力的调控作用截然相反，提示 CRISPR-Cas 系统功能具有亚型特异性。该研究不仅拓展了对细菌 CRISPR-Cas 系统多重功能的认知，更首次将 Cas3 蛋白作为鲍曼不动杆菌感染治疗的潜在靶点，为开发新型抗菌策略（如抑制 Cas3 活性或干扰其调控通路）提供了重要理论依据，有望为应对多重耐药鲍曼不动杆菌感染开辟新方向。
