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脊髓运动神经元（SpMNs）调控肌肉收缩，其多样性对运动功能至关重要。但产后发育中三维（3D）形态变化研究受限。本研究用平铺光片显微镜（TLSM）结合组织透明化，分析颈、腰脊髓运动神经元胞体大小及树突分支，发现上肢相关神经元早于下肢分化，为揭示 SpMNs 多样性提供新视角。
脊髓运动神经元（SpMNs）作为运动指令的最终执行者，在调控肌肉收缩、协调肢体运动中扮演核心角色。然而，这类神经元在产后发育过程中如何形成形态与功能多样性，长期以来因缺乏高通量三维（3D）成像工具而难以深入解析。传统的二维组织学评估无法捕捉神经元的空间分布与立体结构动态，导致学界对 SpMNs 在脊髓中的组织模式及其发育规律知之甚少。例如，α 运动神经元（αMNs）与 γ 运动神经元（γMNs）虽在功能上分别支配骨骼肌纤维与肌梭，但它们在产后发育中的形态分化时序、空间分布差异等关键问题尚未明确。
为破解这些难题，浙江大学、西湖大学及西湖生命科学与医学实验室的研究团队开展了系统性研究。团队以 ChAT-eGFP 转基因小鼠为模型，结合平铺光片显微镜（TLSM）与 CUBIC-L 组织透明化技术，对产后不同阶段（P1、P7、P14、P28、P56）颈髓和腰髓的内侧运动柱（MMC）与外侧运动柱（LMC）神经元进行高分辨率三维成像，并通过腺病毒（AdV）标记技术追踪支配屈伸肌的运动神经元树突结构。相关成果发表在《Cell Regeneration》，为解析脊髓运动系统的发育机制提供了关键数据。
研究采用的核心技术包括：
- TLSM 成像与组织透明化：利用 TLSM 对厘米级透明化脊髓样本进行快速 3D 扫描，结合 CUBIC-L 技术消除组织散射，实现亚微米级分辨率成像。
- 半自动分割与深度学习算法：通过 Amira 软件的深度学习模块（DL Training-Segmentation 3D）对密集的运动神经元胞体进行半自动分割，结合中值滤波、分水岭算法等实现单细胞精准识别。
- 腺病毒逆行标记：通过肌肉注射 AdV-eGFP/tdTomato，逆行标记支配胫骨前肌（TA，屈肌）和腓肠肌外侧头（GL，伸肌）的运动神经元，结合 3D 体积重建分析树突分支模式。
胞体大小动态与神经元分化
通过对颈髓和腰髓运动神经元胞体的三维体积分析，研究发现：
- 上肢支配神经元的早期分化：颈髓 LMC 和 MMC 神经元在 P14 时胞体大小分布出现双峰值，提示分化为大、小两个亚群（推测分别为 αMNs 和 γMNs），其中小胞体亚群占比约 31%-35%。
- 下肢支配神经元的延迟分化：腰髓运动神经元直至 P28-P56 才出现明显的双峰值分布，表明其分化进程晚于颈髓神经元。
- 空间分布异质性：成熟脊髓中，γMNs（小胞体）与 αMNs（大胞体）的空间分布并非均匀混合，而是呈现区域性聚集，暗示其与靶肌肉类型的特异性关联。
树突分支的发育模式
利用 AdV 标记技术对单个运动神经元树突进行追踪，发现：
- 分支数量的动态变化：无论是屈肌还是伸肌支配的神经元，树突分支数量随分级（order）增加先升后降，第 4-5 级分支密度最高，表明树突在中远端区域形成主要计算单元。
- 长度与弯曲度的调控：TA 神经元树突长度在 P4-P14 显著增长，P14 后趋于稳定；GL 神经元则持续增长至 P56。而树突弯曲度（tortuosity）在发育过程中无显著变化，提示其形态稳定性。
- 功能与代谢的平衡：树突结构的复杂性体现了突触输入整合与代谢成本的优化，成熟神经元的树突架构已接近成年模式，为运动控制的精准性奠定基础。
研究结论与意义
本研究首次通过高通量三维成像与定量分析，揭示了脊髓运动神经元产后发育的时空规律：上肢相关神经元通过胞体大小分化优先建立功能特化，下肢神经元则伴随运动需求延迟成熟。树突分支的动态调控表明，神经元通过优化分支结构增强信号处理效率。这些发现不仅为理解运动系统的发育编程提供了形态学证据，也为肌萎缩侧索硬化（ALS）等选择性累及 αMNs 的神经退行性疾病提供了新视角 —— 例如，αMNs 的大胞体特性可能与其高代谢需求和易损性相关。
研究建立的 TLSM 联合组织透明化、半自动分割等技术体系，为中枢神经系统神经元的高通量形态分析提供了标准化方案。未来结合分子标记与电生理技术，可进一步解析 γMNs 与 αMNs 的功能异质性，深化对运动控制与疾病机制的理解。
