综述：奶牛动物中 β- 乳球蛋白基因的 CRISPR-Cas9 敲除研究

这篇综述聚焦于利用 CRISPR-Cas9 技术敲除奶牛动物 β- 乳球蛋白（BLG）基因。阐述了牛奶营养价值与 BLG 致敏问题，介绍技术原理及应用，探讨脱靶效应、伦理等问题，对推动低敏奶制品研发意义重大。

　　

引言

牛奶是全球广泛食用的健康食品，富含动物蛋白、脂肪、矿物质（如镁、钙、硒）和维生素（如维生素 B₁₂、核黄素、维生素 B₅） 。全球牛奶产量主要源于奶牛（82.5%）和水牛（13.7%），山羊、绵羊和骆驼奶占比相对较小。水牛乳在制作奶酪、凝乳和酸奶时产量更高，因其含有更多固体成分。山羊作为重要家畜，既能产奶，又能提供肉和皮革 。如今，家庭奶牛养殖也因牛奶的高营养价值而兴起。

然而，β- 乳球蛋白是一种对人类具有较高致敏性的蛋白质 。牛奶中 β- 乳球蛋白的浓度，在奶牛中平均为 2 - 4g/L，在水牛中约为 3.9g/L 。β- 乳球蛋白基因（BLG，也叫 PAEP 基因）长度为 4193bp，包含 7 个外显子和 6 个内含子，编码核脂质钙结合家族蛋白 。该基因有 A、B 两种等位基因，可形成 AA、BB、AB 三种基因型 。β- 乳球蛋白由 162 个氨基酸组成，能在牛奶中组装成稳定的二聚体，单个单体分子量为 18kDa 。

CRISPR-Cas9 技术的出现，让精确高效地修改遗传物质成为可能 。它利用 Cas9 酶和单导向 RNA（sgRNA）切割 DNA 。与转录激活样效应核酸酶（TALENs）、锌指核酸酶（ZFNs）等技术相比，CRISPR/Cas9 操作更简便，结果更可靠，产生不良影响的几率也更低 。

为减少牛奶过敏，除基因编辑外，还有其他方法，如热处理、糖基化和酶水解等，但这些传统方法存在成本高、影响营养价值、甚至可能增加致敏性等问题 。而基因编辑技术能精准改变导致牛奶致敏的基因，同时维持牛奶品质 。例如，将 BLG 特异性的 CRISPR sgRNAs 与 Cas9 mRNA 共注入动物胚胎，再通过体细胞克隆技术（SCNT），成功培育出敲除 BLG 基因的水牛，其牛奶中检测不到 BLG 蛋白 。

不过，CRISPR 技术目前也面临挑战。在涉及基因编辑动物的研究中，部分出现了脱靶突变，可能导致基因沉默或功能丧失 ，还可能引发免疫系统反应 。此外，该技术在环境可持续性、人类健康、动物福利以及社会经济等方面存在伦理问题，人们担心基因编辑生物释放到环境中会破坏自然生态系统 。

CRISPR-Cas9：改变基因编辑的未来

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPRs）是原核生物中存在的重复回文 DNA 序列，其间穿插着非回文片段 。CRISPR 和 CRISPR 相关（Cas）蛋白是古细菌和细菌抵御来自质粒和噬菌体的入侵核酸的防御组件 。1987 年，Y Ishino 首次描述了 CRISPR 的结构，之后这一缩写被广泛使用。

敲除奶牛动物中的 β- 乳球蛋白

锌指核酸酶和转录激活样效应核酸酶等工程核酸酶为活细胞或生物体的基因组编辑带来了新工具 。这些酶能在基因组的特定位点产生双链断裂（DSBs），细胞可通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）方式修复 。在牛细胞中，应用 ZFN 可使 BLG 基因的两个等位基因发生修饰，引发 NHEJ 。

CRISPR Cas-9 的脱靶效应

CRISPR/Cas9 应用的主要难题是可能在基因组中产生意外或未获批的突变 。目前已开发多种策略来识别 CRISPR/Cas9 忽略的基因组位点 。在保持特定靶向酶活性的同时降低 CRISPR/Cas9 的非预期效应颇具挑战，选择优化的 sgRNA 对于靶向 DNA 序列至关重要。

结论

CRISPR Cas9 技术在敲除多种奶牛动物牛奶中的 β- 乳球蛋白（BLG）基因方面展现出巨大潜力，有望生产出低敏奶制品，降低个体过敏风险 。该技术已成功应用于山羊、水牛和绵羊 。随着研究的不断深入，这一方法有望成为减少牛奶过敏的实用解决方案。