基于RPA-CRISPR/Cas12a系统的大黄鱼假单胞菌快速可视化检测平台的开发

针对水产养殖中假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）早期检测难题，研究人员开发了一种基于RPA-CRISPR/Cas12a系统的快速可视化检测平台。该技术靶向保守gyrB基因，结合重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a的荧光信号放大功能，实现2.34×102拷贝/反应的灵敏度，并通过侧流层析试纸条（LFS）实现裸眼判读。该方法无需专业设备，为水产病原体现场诊断提供了高效解决方案。

　　

论文解读

水产养殖业面临假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）的严重威胁，这种革兰氏阴性菌可引发内脏白点病，导致大黄鱼等经济鱼种大规模死亡。传统检测依赖耗时2-3天的细菌培养，而现有分子检测技术又受限于设备依赖性和操作复杂性。更棘手的是，该病原体在16-22°C的适温范围内爆发迅速，且尚无商业化疫苗或药物。面对这一困境，浙江省海洋水产研究所的研究团队在《Aquaculture》发表论文，开发了一种基于RPA-CRISPR/Cas12a系统的现场化检测方案。

研究采用重组酶聚合酶扩增（RPA，一种等温核酸扩增技术）结合CRISPR/Cas12a的荧光信号放大系统，靶向假单胞菌高度保守的gyrB基因（DNA旋转酶B亚基）。通过临床样本验证和侧流层析试纸条（LFS）可视化读值，实现了无需仪器的快速诊断。

主要技术方法
研究首先构建含gyrB基因的pUC19质粒作为阳性对照，设计特异性crRNA引导Cas12a切割FAM-N7-BHQ1荧光报告分子。通过RPA预扩增提升灵敏度，利用Cas12a的trans-切割活性实现信号放大。检测体系在qPCR仪中定量荧光，同时开发LFS实现裸眼判读。实验验证了12种鱼类病原体的交叉反应性，并测试了人工污染样本和临床病鱼的检出限。

研究结果

Bacteria strains and plasmid construction
通过比对Pseudomonas属gyrB基因保守区（GenBank AB178862.1），设计出特异性RPA引物和crRNA。将1045bp的gyrB片段克隆至pUC19载体，转化E. coli DH5α后获得标准品，为后续灵敏度测试提供基准。

Detection of P. plecoglossicida with CRISPR/Cas12a assay
该体系在40分钟内完成检测，对P. plecoglossicida的检出限达2.34×10²拷贝/反应，比常规PCR敏感100倍。LFS方案使结果可通过试纸条红线直接判读。特异性测试显示，与P. aeruginosa等近缘菌种及嗜水气单胞菌等常见鱼类病原体均无交叉反应。

Discussion
研究突破传统检测的时空限制，将诊断时间从3天缩短至1小时内。CRISPR/Cas12a系统的高特异性克服了RPA可能产生的非特异性扩增问题。LFS的引入使该技术适用于养殖场等资源有限场景，为"早发现、早隔离"提供技术支撑。

结论与意义
该研究首次将RPA-CRISPR/Cas12a-LFS联用技术应用于水产病原体检测，创建的大黄鱼假单胞菌诊断平台具有三大创新点：一是通过gyrB靶标设计实现属内精准鉴别；二是2.34×10²拷贝的高灵敏度满足早期诊断需求；三是LFS与荧光双读值模式兼顾实验室与野外场景。目前团队已就该项技术申请中国发明专利（202411516625.3），为水产病害防控提供了颠覆性的技术工具。