探秘肠道病毒 D 属：唾液酸作为附着因子的关键作用及潜在影响

肠道病毒 D 属（EV-D）对人类健康影响渐显，如 2014 年 EV-D68 引发严重呼吸窘迫等。本文研究发现，EV-D111 与其他 EV-D 成员类似，依赖唾液酸（Sias）进行最佳复制。该研究有助于理解 EV-D111 生物学特性及潜在威胁。

　　

肠道病毒 D 属概述

肠道病毒（Enterovirus，EV）属于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae），其基因组为单链正向 RNA。目前，肠道病毒属包含 15 个种，其中 7 种可感染人类。依据系统发育标准和分子分型方法，肠道病毒被分为不同的种和病毒型。

肠道病毒 D 属（Enterovirus D，EV-D）具有独特之处。其一，该属仅有 5 种血清型，而其他感染人类的肠道病毒种通常含有数十种血清型。其二，EV-D 成员的组织嗜性差异显著，例如 EV-D68 是呼吸道病毒，EV-D70 具有强烈的眼部嗜性，EV-D94、EV-D111 和 EV-D120 似乎主要在肠道中复制。其三，部分 EV-D 病毒的起源可能是人畜共患，像 EV-D70 在非洲引发急性出血性结膜炎大爆发前，已在 domestic animals 血清中检测到针对它的抗体；EV-D111 和 EV-D120 在非人类灵长类动物（non-human primates，NHPs）粪便中被发现，这表明它们可能源于动物。

研究背景与目的

此前研究表明，EV-D68、EV-D70 和 EV-D94 利用唾液酸（sialic acids，Sias）作为细胞附着因子。然而，关于 EV-D111 是否利用 Sias 尚不清楚。本研究旨在探究 Sias 在 EV-D111 感染过程中的作用，同时研究猿猴肠道病毒 EV-B114 对 Sias 的利用情况，以深入了解肠道病毒的感染机制和进化特征。

材料和方法

1. 细胞和病毒：实验选用人类横纹肌肉瘤来源的 RD 细胞和恒河猴肾来源的 LLC-MK2 细胞。所用病毒包括 EV-D111、EV-D68、EV-D70、柯萨奇病毒 B3（Coxsackievirus B3，CVB3）以及猿猴肠道病毒 EV-B114。
2. 病毒感染：在感染前一天，将 RD 细胞或 LLC-MK2 细胞接种于 12 孔板，次日用无血清接种物以不同感染复数（multiplicity of infection，MOI）感染细胞，孵育 1 小时后更换培养基，感染结束后经冻融和离心处理，收集细胞上清液储存于 -80°C。
3. 去除细胞表面唾液酸：使用两种神经氨酸酶（neuraminidase，NA）处理细胞，一种可特异性去除 Sias α2,3，另一种可去除所有 Sias 亚型（α2,3、α2,6 和 α2,8），处理后进行病毒感染实验。
4. 病毒滴定：采用 10 倍稀释法，将不同稀释度的病毒样本接种于 RD 细胞，培养 7 天后通过显微镜观察细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），使用 Spearman-K?rber 方法计算半数组织培养感染剂量（median tissue culture infectious dose，TCID₅₀）。
5. RNA 提取和实时 RT-PCR 分析：使用 QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取病毒 RNA，利用 TaqMan 实时 RT-PCR 技术定量病毒 RNA，通过标准曲线将阈值循环数（Ct）转换为等效 TCID₅₀/mL。
6. 构建敲除细胞系：利用 CRISPR-Cas9 技术，通过两对 sgRNAs 靶向 CMAS 基因的外显子 3 和外显子 8，构建 CMAS 基因敲除的 RD 细胞系，同时设置非靶向 gRNA 转导的细胞作为对照。
7. 蛋白质免疫印迹（Western blot）：裂解细胞后，进行蛋白质变性、电泳分离和转膜，依次用抗 CMAS 和抗 GAPDH 抗体孵育，再用二抗孵育，通过红外成像系统成像并定量蛋白质水平。
8. 免疫荧光检测：感染细胞后固定、通透和封闭，用抗 VP1 和抗 dsRNA 抗体染色，再用二抗孵育，使用 Hoechst 染核，通过共聚焦显微镜成像并分析感染细胞比例。
9. 病毒结合实验：将细胞接种于 12 孔板，部分细胞用 NA 处理，加入 EV-D111 后在冰上孵育，洗涤去除未结合病毒，提取 RNA 进行 RT-PCR 分析，评估病毒结合情况。
10. 病毒 RNA 转染：先使用含纳米荧光素酶基因的体外转录本评估细胞转染效率，再将 EV-D111 病毒 RNA 转染至野生型（WT）和敲除（KO）细胞系，通过病毒滴定检测感染性病毒颗粒的产生。

实验结果

1. EV-D111 利用唾液酸感染人类 RD 细胞：用 NA 处理细胞后，与未处理细胞相比，EV-D111 感染的 RD 细胞中病毒 RNA 产量和感染性病毒颗粒产生显著降低，与阳性对照 EV-D70 表现相似，而阴性对照 CVB3 不受影响，表明 EV-D111 感染依赖 Sias。构建 CMAS 基因敲除的 RD 细胞系，CMAS KO 细胞感染 EV-D111 后，病毒 RNA 产量和感染性病毒颗粒产生较对照细胞明显减少，且感染细胞比例降低，病毒结合量也减少，进一步证实 EV-D111 利用 Sias 感染人类 RD 细胞。
2. EV-D111 似乎特异性结合 Sias α2,3 感染 RD 细胞：用特异性去除 Sias α2,3 的 NA（NA α2,3）和去除所有 Sias 亚型的 NA（NA α2,3-6-8）处理细胞后感染病毒，发现 EV-D111 与 EV-D70 类似，两种 NA 处理对其病毒产量影响无差异，而 NA α2,3-6-8 处理对 EV-D68 病毒产量影响更大，表明 EV-D111 主要利用 Sias α2,3 感染 RD 细胞。显微镜分析和病毒结合实验也证实，去除 Sias α2,3 显著降低 EV-D111 感染细胞比例和病毒结合量。
3. 猿猴肠道病毒 EV-B114 的复制不依赖唾液酸：用 NA 处理 RD 细胞后感染 EV-B114，发现处理组和未处理组的病毒 RNA 产量和感染性病毒颗粒产生无显著差异。在 LLC-MK2 细胞中进行相同实验，结果显示 EV-D70 和 EV-D111 感染受 NA 处理显著抑制，而 CVB3 和 EV-B114 不受影响，表明 EV-B114 感染不依赖 Sias。对比 EV-Ds 和 EV-B114 的衣壳氨基酸序列，发现 EV-Ds 中与 Sias 相互作用的氨基酸在 EV-B114 中存在差异，如 VP1 蛋白序列有 9 个氨基酸缺失，其中包含 3 个与 Sias 结合相关的氨基酸，这可能是 EV-B114 不利用 Sias 的原因。

讨论

唾液酸在众多病毒的自然史中发挥重要作用，作为附着因子可帮助病毒跨越物种屏障。在肠道病毒属中，虽然利用 Sias 较为罕见，但已有研究表明 EV-D 属中多种病毒依赖 Sias。本研究发现 EV-D111 也利用 Sias 感染细胞，且主要结合 Sias α2,3，这一特性可能是 EV-D 属的祖先特征，并非细胞培养适应的结果。

EV-D 属病毒的组织嗜性和 Sias 结合偏好存在差异，且与病毒的系统发育关系不一致。例如，EV-D68 偏好 Sias α2,6，具有呼吸道嗜性；EV-D70 和 EV-D111 主要结合 Sias α2,3，分别引起眼部和肠道相关感染。推测 EV-D 属病毒最初可能具有肠道嗜性，通过改变 Sias 利用方式和跨越物种屏障，获得了更广泛的组织嗜性，从而对人类致病，如柯萨奇病毒 A24 变异株（CVA24v）获得结合 Sias α2,3 的能力后，引发急性出血性结膜炎。

EV-D111 和 EV-D120 在野生 NHPs 粪便中被发现，提示其可能存在人畜共患起源。然而，并非所有猿猴肠道病毒都利用 Sias，如 EV-B114 感染不依赖 Sias。对 EV-D111 的研究表明，其在人类中的传播有限，但随着城市化进程中人与野生灵长类动物接触增加，存在潜在的爆发风险。

综上所述，本研究认为 EV-D111 可能采用两步进入细胞的机制，首先结合 Sias α2,3 增加与受体接触概率，然后通过未知受体触发内吞和衣壳构象变化，释放病毒基因组。目前，EV-D111 的受体尚未明确，深入研究其感染机制对于理解病毒进化和潜在威胁至关重要。